NA質量并不好。目 前微生物多樣性研究的擴增循環數有選擇25的，也有選擇30的，還有一些其他的選擇，但結 果不好判定。總之在樣品準備的過程中，尚沒有標準操作方法。 實施例
[0026]為更好地說明本發明，便于理解本發明的技術方案，本發明的典型但非限制性的 實施例如下。其中所用微生物均由華中農業大學生命科學技術學院農業微生物學國家重點 實驗室提供，所用無機鹽均購自常規化學試劑供應商，所述操作均為常規操作。
[0027]復雜樣品以土壤為例，簡單樣品以食糜為例。土壤樣品為山東冬季未經圍填的距 離圍填海區域1.5公里、距表層15 cm的植物根系土壤;食糜樣品為羊瘤胃胃液。
[0028] (1) DNA提取 a. 直接稱取250mg土壤樣品進行后續操作;對于食糜樣品，首先吸取1.5ml置于離心管 中，12000g離心5min，除去上清，然后加入1.5ml PBS，充分重懸后，12000g離心5min，再次除 去上清后保留沉淀進行后續操作； b. 加入800 1 CTAB緩沖液，在渦旋振蕩器上擊打2min(CTAB的配方：CTAB 4g，NaCl 16.364g，lM Tris-HCl 20ml (ρΗ8·0), 0.5M EDTA 8ml，先用70ml dd H20溶解，再定容至 200ml滅菌）； c. 加入0.3g 0.1mm研磨珠和O.lg 0.5mm研磨珠，在禍旋振蕩器上擊打30min; d. 70°C 解育20min后，10000g離心10min; e. 將上清轉移到新的離心管中，加入5μ1 RNAase (10mg/ml)，37°C孵育30min; f. 加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1)，渦旋震蕩30s至液體呈白色乳濁液； g. 12000g 4°C離心10min，取上清液至新的離心管中； h. 重復步驟e、f和g-次； i .加入0.8倍體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫放置5min，然后于-80°C放置30min沉淀 DNA； j · 12000g離心15min，可以看到白色DNA沉淀； k. 小心倒出上清，加入750μ1 70%的乙醇，充分重懸白色沉淀； l. 12000g離心15min，倒出上清，倒置離心管室溫放置10min; m. 加入50μ1 70°C預熱的去離子水，充分溶解。
[0029] (2) PCR擴增 a.擴增片段選擇16s V3區，擴增引物： 338F:5'-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' 518R:5，-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'
(3)文庫構建 擴增后的產物經凝膠回收后，按照每個樣品1 〇〇ng混勾，使用Bi〇〇 Sc ientif i c公司的 Nextflex rapid DNA sequencing kit進行建庫。
[0030] a.吸取32ul上述混勻的PCR產物至新的PCR管，不足32ul用水補足； b. 每管加入 15ul NEXTflex End-Repair & Adenylation Buffer Mix和3ul NEXTflex End-Repair & Adenylation Enzyme Mix，混勾 10次； c. 22°C孵育20min;然后72°C孵育20min; d. 冰上每管再加入以下試劑： NEXTflex Ligase Enzyme Mix 47.5ul NEXTflex DNA Barcode 2.5ul 最終使體系成為l〇〇ul; e. 22°C孵育 15min; f. 向體系中加入160ul充分混勻的AMPure XP beads，輕輕吹打均勻，室溫孵育15min; g ·室溫放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上，吸棄上清； 注：以下用80%乙醇的洗雜步驟，反應管均置于磁力架上進行； h. 向置于磁力架上的反應管中加入200ul 80%乙醇，室溫孵育30s，吸棄上清； i. 重復步驟h; j. 室溫靜置15min以晾干磁珠； k. 每管加入52.5ul RSB(Resuspension Buffer)，充分混勾磁珠； l. 室溫孵育2min，然后磁力架靜置5min，吸取50ul上清至一新的EP管； m. 每管再加入50ul充分混勻的AMPure XP beads，輕輕吹打均勻，室溫孵育15min; η ·室溫放置磁力架至少5min，使磁珠充分吸附在磁力架上，吸棄上清； 以下用80%乙醇的洗雜步驟，反應管均置于磁力架上進行； 〇.然后向置于磁力架上的反應管中加入200ul 80%乙醇，室溫孵育30s，吸棄上清； P.重復步驟〇; q. 室溫靜置15min以瞭干磁珠，每管加入22.5ul RSB(Resuspension Buffer)，充分混 勻磁珠； r. 室溫孵育2min，然后磁力架靜置5min，吸取20ul上清至一新的PCR管。
[0031] s ·每管加入 2ul NEXTflex Primer Mix，再加入 12ul NEXTflex PCR Master Mi x，補水16u 1，將體系調整到50u 1，充分混勻； t. 按以下程序進行PCR
u. 凝膠回收擴增產物，要求:2%凝膠，預冷TAE buffer，120vi*1.5-2h。
[0032] (4)上機測序和數據分析 文庫經2100檢測和QPCR定量后，在Miseq機器上采取PE 2*150的模式進行測序。下機的 測序數據需要經過數據分析才能得到樣品中微生物的群落組成。對測序得到的原始數據進 行過濾，去掉接頭和低質量的reads，得到可用于后續分析的clean data，并用fastqc軟件 對數據進行質量評估。然后使用FLASH軟件對clean data進行組裝，獲得更多含barcode的 reads。然后使用QHME軟件根據barcode序列將該組裝結果回歸樣品，并對每個樣品的序列 數進行統計。然后使用uclust軟件根據序列相似性（閾值為97%)進行聚類，得到0TU(操作分 類單元)序列，并進行優化和分類。本研究采用菌群豐富度指數chaol、ACE，菌群多樣性指數 Simpson、Shannon和菌群覆蓋度指數goods coverage、observed species對菌群進行多樣 性分析。最后使用green genes數據庫(201305版本)并根據分類學分析結果，分析樣品在各 分類水平上的物種組成比例情況。
[0033] S-TG:天根提取的土壤樣品DNA; S-N:新方法提取的土壤樣品DNA; C-TG:天根提取的食糜樣品DNA; C-N:新方法提取的食糜樣品DNA。
[0034] 表2不同提取方法對微生物種類的影響
表3不同擴增循環數對微生物種類的影響
仕刖IMJtfJ畑迚十，符河傘觀項忟不八臾牡芴芴見的定P」河込生僅明;ii行 不同的替換和修改而不偏離本發明的范圍和精神。這里說明性描述的本發明可在無任何未 在此具體公開的元素或元素、限制或限制的情況下實踐。已被使用的術語或表述被用作說 明書的術語而不是限制，且不旨在使用排除任何所顯示和描述的其部分的特征的等同物的 這樣的術語和表述，但認識到的是在本發明的范圍內多種修飾是可能的。因此，應理解的 是，盡管已通過具體實施方案和任選的特征說明了本發明，領域技術人員可進行這里公開 的概念的修飾和/或變化，且這樣的修飾和變化被認為是在本發明的范圍內。
【主權項】
1. 一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法，包括： (1) 將含微生物的樣品加入CTAB緩沖液并振蕩； (2) 加入至少兩種不同粒徑的研磨珠并振蕩； (3) 37-90°C解育5-60min后離屯、取上清； (4) 在步驟(3)得到的上清加入RNAase并解育； (5) 加入苯酪/氯仿/異戊醇的混合物，振蕩后離屯、取上清； (6) 在步驟巧)得到的上清中加入乙醇或異丙醇沉淀DNA; (7) W步驟(6)得到的DNA為模板，進行PCR擴增，得到用于檢測的樣品。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述不同粒徑的研磨珠為至少兩種不同粒徑的研 磨珠，其粒徑各自獨立地在0.05 mm至1 mm的范圍內且相鄰大小的粒徑相差0.1至0.6 mm。3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中在步驟(3)中，60-80°C解育10-30min后離屯、取 上清;更優選地，70°C解育20min后離屯、取上清。4. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述苯酪/氯仿/異戊醇的混合物的體積為步驟 (4)中的上清體積的1-1.5倍;優選地，所述苯酪/氯仿/異戊醇的混合物的體積與步驟(4)中 的上清體積相等； 優選地，所述苯酪/氯仿/異戊醇的混合物中苯酪/氯仿/異戊醇的體積比為10-50:10-50:0.5-2;更優選地，苯酪/氯仿/異戊醇的體積比為20-30:20-30:1;最優選地，苯酪/氯仿/ 異戊醇的體積比為25:24:1。5. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述PCR擴增進行25個循環。6. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述PCR擴增進行30個循環。7. 根據權利要求1或2所述的方法，其中所述PCR擴增的目的片段為所述微生物的16s V3區;優選地，其中所述PCR擴增的擴增引物為： F:5'-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' R:5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3'。8. -種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法，包括： (1) 將含微生物的固體樣品加入CTAB緩沖液中并振蕩； (2) 加入0.1 mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振蕩； (3) 70°C解育20min后離屯、取上清； (4) 將上清加入RNAase并解育； (5) 加入等體積的25:24:1的苯酪/氯仿/異戊醇的混合物，振蕩后離屯、取上清； (6) 重復步驟(4)和巧）； (7) 加入乙醇或異丙醇沉淀DNA; (8) 離屯、得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涂后溶解在去離子水中； (9) W步驟(8)得到的DNA為模板，進行PCR擴增25或30個循環，得到用于檢測的樣品。9. 一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法，包括： (1) 將含微生物的液體樣品離屯、除去上清，加入PBS充分重懸后，再次離屯、除去上清后 向沉淀中加入CTAB緩沖液中并振蕩； (2) 加入0.1 mm研磨珠和0.5mm研磨珠并振蕩； (3) 70°C解育20min后離屯、取上清； (4) 將上清加入RNAase并解育； (5) 加入等體積的25:24:1的苯酪/氯仿/異戊醇的混合物，振蕩后離屯、取上清； (6) 重復步驟(4)和巧）； (7) 加入乙醇或異丙醇沉淀DNA; (8) 離屯、得到白色DNA沉淀，用乙醇洗涂后溶解在去離子水中； (9) W步驟(8)得到的DNA為模板，進行PCR擴增25或30個循環，得到用于檢測的樣品。10.根據權利要求8或9所述的方法，其中所述PCR擴增的目的片段為所述微生物的16s V3區；所述PCR擴增的擴增引物為：
【專利摘要】本發明涉及微生物多樣性檢測領域，具體涉及一種適用于高通量測序平臺的微生物多樣性檢測樣品制備方法。主要解決目前多樣性測序過程中尚無統一的樣品制備方法標準，導致結果良莠不齊的問題。本發明針對復雜和一般性樣品，在DNA提取方法和擴增循環數的選擇上都做了比較和改進，通過最終測序數據的比較，確定了一套針對不同樣品的標準制備方法。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105647906
【申請號】
【發明人】安云鶴, 田彥杰, 王金龍, 武會娟, 李越, 高麗娟, 馬凱
【申請人】北京市理化分析測試中心
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月21日