一種用于靶向雜交捕獲的修飾性dna雜交探針的制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜 交探針的制備方法。
【背景技術】
[0002] 2003年，〃人類基因組計劃〃獲得首張人類全基因組圖譜，這一成果引領開辟了基 因組學分析、個體化醫療。伴隨著人類技術的革新，二代測序技術（Next Generation Sequencing)出現在人們的視野，它可以一次性完成數十萬到數百萬條DNA分子的序列測 定，使得在極短時間內對基因組進行細致研究成為可能。大量研究表明，人類疾病特別是癌 癥的產生與其個體相關基因的單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP) 有著顯著的相關性。盡管與傳統測序技術相比，下一代測序技術的成本大幅降低，但目前測 序一套個人基因組圖譜仍然高達數萬人民幣，而由于受到測序深度的限制，幾乎無法提供 指標意義判讀的數據。所以，在現階段，如何實現對大批量樣本的某個特定區域進行高通量 平行靶向樣本制備并測序，確定和了解涉及人類疾病的遺傳變異，提高診斷、治療和預防疾 病的能力，對許多科學和臨床醫學研究具有重大意義。
[0003] 靶向測序文庫制備技術充分發揮了二代測序技術的潛能，與全基因組測序相比， 富集后再測序大大降低了成本，減輕了后續數據分析的壓力，讓研究人員能夠充分利用二 代測序的通量。由于存在著非常高的技術壁皇，目前幾種靶向富集方法主要包括以基于 RNA:DNA核酸雜交層面上的靶向序列捕獲系統。其中基于微陣列芯片上合成制備寡核甘酸 池，然后再進一步體外制備RNA探針，雖然在探針制備上具有極強的靈活性，但是RNA雜交捕 獲探針不具有穩定性，需要嚴格的儲藏與運輸條件。同時由于所用的所使用的探針為RNA， 需要極高的操作要求、試劑以及實驗器皿都需要是無 RNA酶的。對于實驗操作人員的技術要 求性極高。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方 法，無需RNA探針對于環境和操作的嚴格要求，又保留了 RNA:DNA核酸分子極強結合能力的 性能。
[0005] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0006] -種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)通過平行制備寡核苷酸池獲得包含目標序列以及通用引物區域的DNA模板；
[0008] (2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物進行PCR反應，同時在PCR過程中引入 生物素標記的ATP和甲基化dm 5CTP;
[0009] (3)磁珠富集法純化PCR產物；
[0010] (4)對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化；
[0011] (5)磁珠富集法純化步驟(4)處理后的產物；
[0012] (6)Lambda核酸外切酶水解步驟(5)純化后產物的雙鏈DNA中一條帶有5'端磷酸化 的單鏈，從而獲得帶有生物素標記的單鏈DNA;
[0013] (7)磁珠富集法純化帶有生物素標記的單鏈DNA，得修飾性DNA雜交探針。
[0014] 本發明創造性的點在于步驟2、4、6,以往利用平行制備寡核苷酸池進行捕獲探針 制備，其主要方法為使用Taq酶將平行制備的寡核苷酸池進行PCR擴增，同時在PCR引物端引 入T7啟動子序列，然后利用T7啟動子線性擴增成RNA序列，擴增過程中引入帶有生物素標記 的UTP，最終形成RNA捕獲探針。相比于該方法，本發明的優勢之處在于通過實驗捕獲了單鏈 DNA捕獲探針，使得探針的保存條件更加穩定，同時由于引入了帶有甲基化修飾的DNA堿基， 增強了DNA分子的結合性。
[0015] 作為優選，步驟(2)中所述PCR引物為引物對，包括正向引物和反向引物，正向引物 的序列為5 ' -GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3 '，反向引物的序列為5 ' -UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3 '。 [0016]作為優選，步驟(2)的PCR反應體系中，含有dUTP的PCR引物的終濃度為0.5μΜ。
[0017] 本發明的有益效果是:對于環境和操作的要求較低，保留了 RNA:DNA核酸分子極強 結合能力的性能，本發明極大了降低了生產成本、使用范圍廣，包括任意物種基因組的外顯 子區域、內含子區域、線粒體區域以及內含子區域等。所獲得的DNA雜交探針可以應用于二 代測序靶向文庫的構建以及測序。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的具體說明。
[0019] 本發明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。
[0020] 總實施方案：
[0021 ] -種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法，包括以下步驟：
[0022] (1)通過平行制備寡核苷酸池獲得包含目標序列以及通用引物區域的DNA模板。
[0023] (2)使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物進行PCR反應，同時在PCR過程中引入 生物素標記的ATP和甲基化dm5CTP;所述PCR引物為引物對，包括正向引物和反向引物，正向 引物的序列為5 ' -GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3 '（ SEQ ID No · 1)，反向引物的序列為5'_ UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3 '（SEQ ID No. 2)，正向引物和反向引物由上海生工合成。PCR反應 體系中，含有dUTP的PCR引物的終濃度為0.5μΜ。
[0024] (3)磁珠富集法純化PCR產物。
[0025] (4)對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化。
[0026] (5)磁珠富集法純化步驟(4)處理后的產物。
[0027] (6)Lambda核酸外切酶水解步驟(5)純化后產物的雙鏈DNA中一條帶有5'端磷酸化 的單鏈，從而獲得帶有生物素標記的單鏈DNA。
[0028] (7)磁珠富集法純化帶有生物素標記的單鏈DNA，得修飾性DNA雜交探針。
[0029]具體實施案例：
[0030] 1、試劑和儀器
[0031] 1.1試劑
[0032]
[0035] 2、操作流程
[0036] A.使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物進行PCR反應，PCR反應體系如下：
Γ ? 終濃度 體積
[0037]
[0038]
[0039] 在PCR儀中執行以下反應程序：
[0040]
L0041J
[0042] B.Beads 純化 PCR 產物
[0043] 1.向每管PCR產物中加入3.5倍體積已充分混勻的beads(室溫)并徹底混勻(移液 槍吹打15次）；
[0044] 2.室溫孵育 5min;
[0045] 3.將反應管置于磁力架上至少3min或直至液體澄清；
[0046] 4.將反應管留在磁力架上用移液槍吸取并棄掉上清；
[0047] 5.保持反應管于磁力架上加入200μ1 (新鮮配置)70 %的乙醇溶液，靜置30s，然后 用移液槍棄去乙醇;重復乙醇清洗步驟1次；
[0048] 6.兩次乙醇清洗后，盡可能多的去除乙醇;將反應管置于室溫干燥5min;注意不要 將beads過度干燥(通常7~lOmin);
[0049] 7.干燥完成后，從磁力架上取下反應管并加入18μ1 Nulease-free water，充分混 勻；
[0050] 8.將反應管放回磁力