一種聚合酶鏈式反應的優化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于聚合酶鏈式反應領域，特別涉及一種聚合酶鏈式反應的優化方法。
【背景技術】
[0002] 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種用于放大擴增特定的 DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制。PCR技術由1983年美國 Mull is首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術 的真正誕生，并因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。1973年，臺籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的 Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。PCR的最大特點，是能將微量的DNA大 幅增加，即使目的DNA分子的合成量呈指數增長，因此微量的遺傳物質在數小時內即能擴增 數百萬達到檢測水平，可進行測序、DNA探測、基因分析、食品檢驗、環境監測等。具體說來， PCR的體外酶促合成特異DNA片段，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等三個步驟反復 的熱循環構成。即在高溫(95 °C)下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板;然 后在低溫(37~55°C)情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形 成部分雙鏈;在Taq酶的最適溫度(72°C )下，以引物3 '端為合成的起點，以單核苷酸為原料， 沿模板以5'-3'方向延伸，合成DNA新鏈。如此反復進行，PCR產物得以2n的指數形式迅速擴 增，經過25~30個循環后，理論上可使基因擴增10 9倍以上。PCR技術具有特異性高、靈敏度 高、快速、易自動化等突出優點，徹底改革了分子遺傳學，成為現代生物學和藥物科學最流 行的技術之一，與克隆、DNA序列分方法構成了整個現代分子生物學研究工作的基礎。
[0003] 盡管PCR技術已發展成為一項相當成熟的技術，但在實際操作中，PCR擴增始終存 在一些難以克服的問題，如假陰性、假陽性、非特異性擴增以及片狀拖帶或涂抹帶等，尋找 解決PCR中這些問題的方法至關重要，常規的辦法有向PCR體系中添加各種添加劑，優化PCR 體系的各種參數，改進PCR的擴增策略等，這些方法雖然在一定程度上提高了 PCR的特異性、 產量以及效率，但是并未徹底解決上述難題，PCR擴增仍達不到理想的預期效果。常用的添 加劑有甘油、牛血清白蛋白、二甲基亞砜、甜菜堿、氯化四甲基銨、甲酰胺及單鏈結合蛋白 等。這些優化劑的作用機理各不相同，所適用的范圍也是不一樣的。但是，目前已經發現的 PCR體系優化劑主要是小分子化合物、高聚物以及蛋白質，這些添加劑只可以使擴增體系的 某一方面得到優化;甚至在改善一種特性時會犧牲其它方面，如甜菜堿，提高特異性時產量 會降低;還有一些添加劑在某些體系有作用，在其它體系則無效。
[0004] 自從20世紀90年代初，人們認識到量子尺度效應并提出納米材料的概念以來，在 過去的十幾年里，這一研究領域已經取得了令人矚目的進展。納米材料在生物醫藥領域的 應用研究已經被許多國家列為納米科技發展的重點。納米材料因其獨特的理化性質而越來 越多的被研究者應用到PCR反應中，這為改善PCR技術打開了新的思路，大大拓寬了PCR技術 的應用范圍。
[0005] 經對現有技術文獻的檢索發現，美國專利US PATENT 5,646,019公開了"一種利于 引發擴增核酸模板的制備方法"，該方法是在PCR體系里加入了耐熱的單鏈結合蛋白（SSB， single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只結合單鏈DNA，但不結合雙 鏈DNA，通過結合并抑制含有單鏈的非特異性片段的擴增，從而實現了 PCR擴增的優化。由于 提取純化SSB蛋白技術復雜，試劑純度也要求很高，導致制備成本非常高，商品化試劑盒非 常昂貴，價格是常規PCR試劑的6-7倍;同時為了保持單鏈結合蛋白的生物活性，要求嚴格貯 存于一20°C，并且其生物活性保持期限較短。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種聚合酶鏈式反應的優化方法，該方法增加 PCR反應的特異性，提高PCR目標產物的產量的效果。同時，由于該樹枝狀聚合物復合物成本 低廉，易于保存，相比于其他生物分子添加材料SSB等成本大大降低。
[0007] 為了提高PCR反應的擴增特異性和目標DNA的產量，同時不引起成本的明顯增高， 本發明提供一種新的優化聚合酶鏈式反應的方法。
[0008] 本發明的一種聚合酶鏈式反應的優化方法，有效用量的聚乙烯亞胺PE I或者包裹 納米金顆粒的PEI復合材料作為添加劑加入到聚合酶鏈式反應PCR中；其中，有效用量的確 定方法包括:通過對PEI或者包裹納米金顆粒的PEI復合材料進行梯度稀釋或濃縮，以濃度 梯度方式加入到該聚合酶鏈式反應體系中，以實際擴增達到優化目的的范圍為PEI或者包 裹納米金顆粒的PEI復合材料的有效用量。
[0009] 所述包裹納米金顆粒的PEI復合材料為Au/PEI摩爾比為100:1，200:1，300:1的超 支化的聚乙烯亞胺樹枝狀大分子。
[0010] 所述PEI的末端基團為氨基、乙酰基、羧酸基或羥基。
[0011] 所述聚合酶鏈式反應體系為易產生非特異性擴增的體系、GC含量高的擴增體系、 模板數為低拷貝（小于1〇3)的體系、復雜基因背景體系和人基因組Apolipoprotein E (ApoE)基因的高GC含量擴增體系中的至少一種。
[0012] 所述產生非特異性擴增的PCR再擴增體系可以作為一個典型的體系。PCR再擴增體 系是指以第一次擴增的產物稀釋后作為第二次擴增的模板，進行第二次擴增；當以第一次 擴增的產物稀釋10倍作為第二次擴增的模板，且在常規PCR擴增體系下進行擴增時，會產生 大量的非特異性擴增產物，而如果在該PCR體系中加入適量的特定末端端基的樹枝狀聚合 物材料，則能夠消除這些非特異性擴增，在瓊脂糖凝膠電泳圖上得到單一的目標產物。
[0013] 針對產生非特異性擴增的PCR反應體系，PEI產生優化作用的有效用量為每25yL PCR 反應體系0 · 45 ~0 · 49mg/L。
[0014] 針對產生非特異性擴增的PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為100:1的{(Au)1QQ-PEI-mPEG 24}產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系0.36~0.42mg/L。
[0015] 針對產生非特異性擴增的PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為200:1的{(Au)2Q()-PEI-mPEG 24}產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系0.34~0.39mg/L。
[0016] 針對產生非特異性擴增的PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為300:1的{(Au)3Q()-PEI-mPEG 24}產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系0.24~0.34mg/L。
[0017] 針對產生非特異性擴增的PCR反應體系，乙酰化的Au/PEI摩爾比為200 : 1的 KAu)2(x)-PEI-Ac-mPEG24}產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系40~70mg/L。
[0018] 針對高GC含量PCR反應體系，PEI產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系 12~14mg/L〇
[0019] 針對高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為100:1的{(Au)1QQ-PEI-mPEG 24}產生優 化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系8~10mg/L。
[0020] 針對高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為200:1的{(Au)2Q()-PEI-mPEG 24}產生優 化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系5.6~8mg/L。
[0021] 針對高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為300:1的{(Au)3Q()-PEI-mPEG 24}產生優 化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系4~6mg/L。
[0022] 針對改進的高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為100:1的{(Au)1QQ-PEI-mPEG24} 產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系3.2~4mg/L。
[0023] 針對改進的高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為200:1的{(Au)2Q()-PEI-mPEG 24} 產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系2.4~3.2mg/L。
[0024] 針對改進的高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為300:1的{(Au)3Q()-PEI-mPEG 24} 產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系2~2.8mg/L。
[0025] 針對縮短變性時間至25s的高GC含量PCR反應體系，Au/PEI摩爾比為300: 1的 KAu)3(x)-PEI-mPEG24}產生優化作用的有效用量為每25yL PCR反應體系4mg/L。
[0026] 聚乙烯亞胺(PEI)是一類樹枝狀大分子。PEI的結構有兩種類型：線型PEI和支化 PEI。用于PCR的聚乙烯亞胺基本上都是超支化結構，支化PEI分子量大多為ΖδΟΟ?ΚΡΕΙ分子 由CH2CH 2N結構單元組成，是已知的電荷密度最大的陽離子有機高分子。在生理條件下能部 分質子化可以使PEI分子帶有正電荷。這類分子具有精確的表面功能