架上直到液體澄清;收集上清液到新的管子中并進行下一步 實驗。
[0051 ] C.對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化 [0052] 1.準備以下反應：
[0053]
[0054] 2.將反應管置于預熱的PCR儀中，合上蓋子，37°C孵育15min;
[0055] 3·保持反應管在PCR儀上，加入ΙμL T4DNA聚合酶（300U/ml)，lyldNTP(lmM)，用移 液槍吸取全部體積輕柔吹打6~8次充分混勻。繼續在PCR儀上孵育37°C，10min，然后將反應 管置于冰上。
[0056] 4.選作：取lul稀釋10倍的PCR產物，采用高靈敏度DNA生物分析芯片(Agilent公 司）電泳質檢判斷條帶大小。
[0057] D. Beads純化C步產物
[0058] 1.向每管產物中加入3.5倍體積已充分混勻的beads(室溫)并徹底混勻(移液槍吹 打15次）；
[0059] 2.室溫孵育 5min;
[0060] 3 ·將反應管置于磁力架上至少3min或直至液體澄清；
[0061 ] 4.將反應管留在磁力架上用移液槍吸取并棄掉上清；
[0062] 5.保持反應管于磁力架上加入200ul(新鮮配置)70%的乙醇溶液，靜置30s，然后 用移液槍棄去乙醇;重復乙醇清洗步驟1次；
[0063] 6.兩次乙醇清洗后，盡可能多的去除乙醇;將反應管置于室溫干燥5min;注意不要 將beads過度干燥(通常7~lOmin);
[0064] 7.干燥完成后，從磁力架上取下反應管并加入18μ1 Nulease-free water，充分混 勻；
[0065] 8.將反應管放回磁力架上直到液體澄清;收集上清液到新的管子中并進行下一步 實驗。
[0066] E. Lambda核酸外切酶水解雙鏈DNA中5'端磷酸化的單鏈 [0067] 1.準備以下反應：
[0068]
[0069] 2 .將反應管置于預熱的PCR中，合上蓋子，37 °C孵育30min;之后將反應管置于冰 上；
[0070] 3 ·選作：取ΙμL稀釋10倍的PCR產物采用高靈敏度DNA生物分析芯片(Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip，Agilent公司）電泳質檢判斷條帶大小。
[0071] F · Beads 純化單鏈 DNA
[0072] 1.向每管產物中加入3.5倍體積已充分混勻的beads(室溫)并徹底混勻(移液槍吹 打15次）；
[0073] 2.向樣本-beads的混合液中加入100%的異丙醇并使其終濃度在20%，充分混勻；
[0074] 3.室溫孵育 5min;
[0075] 4 ·將反應管置于磁力架上至少3min或直至液體澄清；
[0076] 5.將反應管留在磁力架上用移液槍吸取并棄掉上清；
[0077] 6.保持反應管于磁力架上加入200ul (新鮮配置)70 %的乙醇溶液，靜置30s，然后 用移液槍棄去乙醇;重復乙醇清洗步驟1次；
[0078] 7.兩次乙醇清洗后，盡可能多的去除乙醇;將反應管置于室溫干燥5min;注意不要 將beads過度干燥(通常7~lOmin);
[0079] 8.干燥完成后，從磁力架上取下反應管并加入20μ1 Nulease-free water，充分混 勻；
[0080] 9.將反應管放回磁力架上知道液體澄清;收集上清液到新的管子中并進行下游實 驗；
[0081 ] 10 ·選作:取ΙμL稀釋10倍的PCR產物采用高靈敏度DNA生物分析芯片(Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip，Agilent公司）質檢判斷條帶大小。
[0082] 雜交捕獲案例：
[0083] 為了進一步檢驗制備的捕獲探針，應用于靶向雜交捕獲的可行性和高性能性，本 實驗設計如下，采用本發明的方法，針對人的18個基因的全外顯子區域進行修飾性DNA雜交 探針的制備，采用制備的DNA雜交探針與DNA文庫進行雜交，并高效富集，然后在HiSeq2000/ HiSeq2500上進行高通量、高深度測序。
[0084] 具體實驗步驟為:將基因組DNA經Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180-280bp的 片段，經末端修復和加 A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。帶有特異index的文 庫pooling后與本發明制備的生物素標記的修飾性DNA雜交探針進行液相雜交，再使用帶鏈 霉素的磁珠將18個基因的外顯子捕獲下來，經PCR線性擴增后進行文庫質檢，合格即可進行 測序。通過對于測序數據的比對分析，即可獲得制備的液相捕獲探針對于目標區域的捕獲 信息，結果見表1和表2。
[0085] 表1所示，18個基因的名字，每個基因捕獲的外顯子區域個數以及大小以及染色體 所在區域：
[0086]
LTO88」表2所不，通]Q：捕獲的測序數據分析，罙又捕獲侏針捕獲的測序數據目稱兇項深度 大于30X的區域所占的比例均大于99%，顯示能夠基本完全捕獲目標序列，18基因的外顯子 測序數據的平均覆蓋深度約為500層(50X):
[0089]
Ο
[0090] 以上所述的實施例只是本發明的一種較佳的方案，并非對本發明作任何形式上的 限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權項】
1. 一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟： (1) 通過平行制備寡核苷酸池獲得包含目標序列以及通用引物區域的DNA模板； (2) 使用Taq聚合酶以及含有dUTP的PCR引物進行PCR反應，同時在PCR過程中引入生物 素標記的ATP和甲基化dm5CTP; (3) 磁珠富集法純化PCR產物； (4) 對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4DNA聚合酶末端平滑化； (5) 磁珠富集法純化步驟(4)處理后的產物； (6) Lambda核酸外切酶水解步驟(5)純化后產物的雙鏈DNA中一條帶有5'端磷酸化的單 鏈，從而獲得帶有生物素標記的單鏈DNA; (7) 磁珠富集法純化帶有生物素標記的單鏈DNA，得修飾性DNA雜交探針。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：步驟(2)中所述PCR引物為引物對，包 括正向引物和反向引物，正向引物的序列為5 ' -GAGCTTCGGTTCACGCAATG-3 '，反向引物的序 列為5 ' -UGCCUAGGACCGGAUCAAC-3 '。3. 根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)的PCR反應體系中，含有 dUTP的PCR引物的終濃度為0.5μΜ。
【專利摘要】本發明公開了一種用于靶向雜交捕獲的修飾性DNA雜交探針的制備方法主要方法為：制備DNA模板，PCR擴增，純化PCR產物；對純化后的PCR產物進行USER酶切割以及T4？DNA聚合酶末端平滑化，Lambda核酸外切酶水解產物的雙鏈DNA中一條帶有5′端磷酸化的單鏈，從而獲得帶有生物素標記的單鏈DNA；磁珠富集法純化帶有生物素標記的單鏈DNA，得修飾性DNA雜交探針。本發明極大了降低了生產成本、使用范圍廣，包括任意物種基因組的外顯子區域、內含子區域、線粒體區域以及內含子區域等。所獲得的DNA雜交探針可以應用于二代測序靶向文庫的構建以及測序。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105647907
【申請號】
【發明人】郎秋蕾, 周小川, 方超, 殷楠楠, 孟佳軍
【申請人】杭州聯川生物技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月4日