一種微生物胞外多糖及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物多糖領域，涉及一種微生物胞外多糖及其制備方法，具體涉及 一種假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01發酵制備的胞外多糖及其制備純化方法。
【背景技術】
[0002] 微生物多糖在細胞內主要有三種存在形式:①黏附在細胞表面上，即胞壁多糖;② 分泌到培養基中，即胞外多糖;③構成微生物細胞的成分，即胞內多糖;而其中的胞外多糖 具有產生量大、易于與菌體分離、可通過深層發酵實現工業化生產。
[0003] 微生物胞外多糖(Extracellular polysaccharides，EPS)是微生物在生長過程中 為適應周圍環境的變化產生的一種對自身具有保護作用的生物高聚物。微生物胞外多糖和 植物多糖相比較具有以下優勢:①生產周期短，不受季節、地域、病蟲害等條件的限制;②具 有較強的市場競爭力和廣闊的發展前景;③應用廣泛。目前已有多種微生物胞外多糖已經 發展成為一類新型的發酵產品，作為增稠劑、穩定劑、乳化劑、保濕劑、膠凝劑、懸浮劑等廣 泛應用于石油、化工、食品和制藥等多個領域。近年來有關海洋微生物和乳酸菌微生物胞外 多糖研究活躍，不斷有新型多糖結構被鑒定。微生物多糖作為天然活性大分子，在生物醫藥 領域的潛在應用價值也日益受到人們的廣泛關注。
[0004] 新菌種的進一步探索成為新型胞外多糖的一個重要來源。CN102816724B公開了一 株放射形根瘤菌，其產生主要由半乳糖和葡萄糖組成的胞外多糖，其胞外多糖水溶性好，且 在低濃度下具有良好的粘度、表面活性、蛋白質可混性以及良好的穩定性和乳化性。 CN102965318B公開了一種產胞外多糖的嗜熱鏈球菌，該菌株在42°C條件下用M17培養液發 酵30小時產胞外多糖148mg/L，胞外多糖可明顯提高發酵乳的粘度和凝膠強度。 CN104232548A公開了 一株假單胞菌，其合成的凝膠多糖為胞外多糖，將發酵條件優化，凝膠 多糖產量可達5.94g/L。
[0005] 此外，不同的微生物菌株往往產生不同類型的胞外多糖，不同的胞外多糖也具有 不同的結構和/性能。到目前為止，已大量投產的微生物胞外多糖有黃原膠(Xanthan gum)、 結冷膠(Gellan g um)、小核菌葡聚糖(Sclee roglucan)、短梗霉多糖(Pullulan)、熱凝多 糖(Curdlan)等。
[0006] 如何開發生產胞外多糖的新菌種、開發新型的胞外多糖以及提高胞外多糖的產 量，是微生物多糖領域技術人員面臨的問題。
【發明內容】
[0007] 在現有技術已有開發微生物多糖的基礎上，本發明提供一株高產細菌胞外多糖的 假單胞菌，并利用該菌株發酵制備胞外多糖及進行多糖純化。該菌株能夠轉化甘油、葡萄 糖、淀粉、檸檬酸鈉等產生凝膠型胞外多糖。
[0008] 發明人從海洋真菌發酵生產DHA的發酵培養污染物中采用常規方法分離篩選得到 一株高產胞外多糖的假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01，該菌株保藏于中國典型培養物 保藏中心(CCTCC)，保藏日期為2016年1月14日，保藏編號為CCTCC N〇:M2016035,保藏地址： 中國武漢武漢大學，其具有如下生物學特征：
[0009]菌株SFEP-01菌落及形態特征：固體培養菌落圓形，凸起，邊緣整齊，表面光滑，淡 黃色、半透明狀;30°C培養24小時，菌落直徑約1mm，培養48小時，菌落直徑約3-5mm(菌落形 態見附圖1，附圖2);菌株SFEP-01為桿菌，不形成芽胞，菌體形態直或稍彎、兩端形狀不規 貝1J，大小0 · 5~0 · 8μπιX 1 · 5~3 · Ομπι(菌體形態見附圖3)，液體培養12小時染色可見菌體外多 糖物質(見附圖4)。
[0010] 菌株SFEP-01生理生化特征是:革蘭氏染色陰性，好氧，最適生長溫度28-30°C，在 25°C生長良好;利用葡萄糖、果糖、檸檬酸鹽，接觸酶陽性;生理生化實驗結果詳見表1。
[0011] 表1菌株SFEP-01的部分生理生化特征
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[0014] 注："+"生長良好或呈陽性；不生長或呈陰性。
[0015] 上述用于菌體形態觀察的液體培養基組成（g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,氯化鈉3， pH7.0-7.2,蒸餾水配制。
[0016] 上述用于菌落形態觀察的固體培養基組成(g/L):蛋白胨10,牛肉膏5,氯化鈉3,瓊 脂15-20，pH7.0-7.2，蒸餾水配制。
[0017] 上述形態特征觀測的實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌系統鑒定 手冊》，科學出版社，2001，第一版，p353-363。
[0018]上述生理生化試驗培養基及實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌系 統鑒定手冊》，科學出版社，2001，第一版，p364-398。
[0019 ]以本發明的菌株SFEP-01的全基因組DNA為模板，采用細菌16 SrDNA通用引物PCR擴 增該菌株16S rRNA基因序列，擴增產物測序得到長度為1399bp的序列（如序列表SEQ ID NO: 1所不），使用美國生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)BLASTN程序比對，發現本發明的菌株SFEP-01 16S rRNA的基因序列與 NCBI注冊的多株淺黃色假單胞桿菌(Pseudomonas luteola)和一些未被完全鑒定的假單胞 菌的16S rRNA的基因序列具有99%的同源性，生理生化試驗結果與《常見細菌系統鑒定鑒 定手冊》中淺黃色假單胞桿菌的特征符合度較高（參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌 系統鑒定手冊》科學出版社，2001，第一版，pl72)，系統發育樹表明該菌株與已知淺黃色假 單胞桿菌親緣關系與其他未鑒定假單胞桿菌菌株(Pseudomonas sp.)沒有顯著區別，因此， 將該菌株初步鑒定為假單胞菌菌種(Pseudomonas sp.)。
[0020] 發明人在發酵過程中發現，利用菌株SFEP-01發酵生產多糖，搖瓶發酵最終發酵液 因為多糖的產生呈固體凝膠狀，說明本發明所述假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發酵 產生多糖具有極強凝膠活性。
[0021] 本發明的一個目的在于提供一種微生物胞外多糖的制備方法，包括：
[0022] 1)利用假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01發酵至發酵液呈凝膠狀，得胞外多糖 發酵液；
[0023] 2)將步驟1)得到的胞外多糖發酵液加水稀釋，離心，收集上清液，真空濃縮至原體 積，加乙醇進行醇沉，收集沉淀干燥后即得胞外多糖粗品。
[0024] 其中，具體的，上述步驟1)中利用假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-〇l發酵的方 法包括步驟如下：
[0025]①將假單胞菌SFEP-01接種于新鮮斜面菌種培養基上，25-30°C培養1-2天得活化 菌體；
[0026]②將步驟①制得的活化菌體接種于液體種子培養基中，25-30°C培養8-24小時，得 種子液；
[0027]③將步驟②制得的種子液接種至發酵培養基，25_30°C發酵48 - 72小時至發酵液 呈凝膠狀，得胞外多糖發酵液。
[0028] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01斜面菌種培養基為(g/L):葡萄糖20- 50，酵母浸粉2-5，氯化鈉2-5，瓊脂粉15-20，pH值調至7.0-7.2。
[0029] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01液體種子培養基為（g/L):碳源10- 60，酵母浸粉3-6，氯化鈉2-5，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2，調整pH值7.0-7.2。
[0030] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發酵培養基為（g/L):碳源40-80,酵 母浸粉3-6，氯化鈉5-8，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2，調整pH值7.0-7.2。
[0031 ] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01液體種子培養基和產胞外多糖發酵 培養基中，碳源可選甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、檸檬酸鹽等，優選為甘油。
[0032] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01產胞外多糖發酵的培養溫度優選為 28±2°C。
[0033] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01液體種子培養時間優選為12-14小 時。
[0034] 上述假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01產胞外多糖發酵培養時間優選為60-70小時。
[0035] 優選的，上述步驟2)中，發酵液(呈凝膠狀)加水稀釋10-50倍，4000-8000r/min離 心10-20min，收集上清液然后再40-60 °C真空濃縮至原發酵液體積，加入1-3倍無水乙醇，充 分混勻，靜置沉淀，然后再經3000-5000r/min離心或過濾收集沉淀，低溫干燥或冷凍干燥即 得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。
[0036]進一步的，本發明所述胞外多糖的制備方法，還包括：
[0037]步驟3)取按上述方法制取的SFEP-01菌株胞外多糖粗品，加緩沖液溶解分散，經 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離，收集洗脫液，經檢測得到兩個分離組分EPSI 和EPS Π ，分別收集EPSI和EPS Π ，適當濃縮后再分別用葡聚糖凝膠G-100柱層析，獲得SFEP-01菌株胞外多糖組分EPSI和EPSII。
[0038] 優選的，胞外多糖粗品，加300-500倍緩沖液溶解分散形成膠體溶液。
[0039] DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離條件為：將離子膠DEAE-Sepharose Fast Flow濕裝柱，用0.05mol/L、pH為7.6的Tris-HCl溶液平衡，將粗多糖樣品用0.05mol/ L、pH為7.6Tris-HCL緩沖液溶解分散溶解后上樣，用1.2mol/L的氯化鈉溶液進行線性梯度 洗脫，洗脫的流速為1