ml收集1管，檢測收集管中的多糖含量， 繪制洗脫曲線，得到EPSI和EPS Π 兩個洗脫峰，，分別收集，將收集液濃縮至多糖含量大約 lg/L，再用葡聚糖凝膠G-100柱層析，將收集液濃縮至多糖含量10-20g/L，再加3倍無水乙醇 沉淀，收集沉淀，冷凍干燥，共得到EPSI5.42g，EPS Π 1.86g。
[0085] 斜面培養基組成為（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,牛肉膏5,氯化鈉3,瓊脂20,調整 pH7.0-7.2,蒸餾水配制。
[0086]發酵用液體種子培養基組成（g/L)甘油20,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉6,硫酸 銨2，調整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0087]發酵用培養基組成(g · Γ1):甘油60,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉3,硫酸銨2,調 整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0088] 實施例5假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01產胞外的抗氧化活性 [0089]收集菌株SFEP-01發酵液加水稀釋30倍，8000r/min離心10min，收集上清液然后再 濃縮至原發酵液體積，加入3倍無水乙醇，充分混勻，靜置沉淀，然后再離心收集沉淀，冷凍 干燥，得胞外多糖粗品。
[0090] 取上述制取的細菌胞外多糖粗品，加緩沖液溶解分散，過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離，得到EPSI和EPS Π 兩個洗脫峰，再用葡聚糖凝膠G-100柱層析，將收集 液濃縮至多糖含量10_20g/L，再加3倍無水乙醇沉淀，收集沉淀，冷凍干燥，共得到EPSI、EPS Π 純品。
[0091] 將上述制取的細菌胞外多糖粗品和EPSI、EPSΠ ，分別配制成溶液，以維生素 C為對 照測定多糖的還原能力和清除超氧陰離子自由基的能力，結果顯示多糖粗品和EPSI的還原 能力和清除超氧陰離子自由基的能力與維生素 C相當（見圖8、圖9)。
[0092] 上述多糖還原能力的測定方法:配制不同濃度的樣品溶液，取25mL比色管，加入樣 品溶液1. OmL，加入0.2M、pH6.6的磷酸鹽緩沖液2.5mL，加入1 %的鐵氰化鉀溶液2.5ml，混合 均勻，50 °C恒溫水浴20min，取出冷水冷卻，再加入10 %的三氯乙酸溶液2.5mL終止反應， 4000rpm離心取上清液2.5mL，加入去離子水2.5mL和0.1 %的三氯化鐵溶液0.5mL，混合均 勻，靜置lOmin，以去離子水做對照，在700nm處測吸光度，吸光度值越大表示還原力越強。 以相同濃度的的維生素 C作為陽性對照。
[0093] 上述清除超氧陰離子自由基的能力的測定方法：配制不同濃度的樣品溶液，取 25mL比色管，加入pH 8.0的50mMTris緩沖液4.5mL，加入樣品溶液2mL，37°C恒溫水浴lOmin， 再加入預溫的7mM鄰苯三酚0.2mL，混合均勻，繼續在37 °C的恒溫水浴4min，加入兩滴濃鹽酸 (10M)終止反應，在320nm處測吸光度。
[0094]清除率計算：
[0095] 清除率（％ )=[卜(Ab-Ac)/Aa] X 100%
[0096] Aa為不加樣品，加入鄰苯三酚時的吸光度；
[0097] Ab為加入樣品和鄰苯三酚的吸光度；
[0098] A。為加入樣品不加鄰苯三酚的吸光度。
[0099] 實施例5假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發酵產胞外多糖
[0100]將28°C培養1天的菌種斜面接種液體種子培養基，25°C培養16小時，按體積比10% 的接種量接入到搖瓶發酵培養基中，30°C培養68小時，結束發酵。稱取lg發酵產物，加水稀 釋150倍，苯酚硫酸法測定的胞外多糖含量為llg/L。
[0101] 斜面培養基組成為（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,牛肉膏5,氯化鈉3,瓊脂20,調整 pH7.0-7.2,蒸餾水配制。
[0102] 發酵用液體種子培養基組成(g/L)甘油20,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉6,硫酸 銨2，調整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0103] 發酵用培養基組成(g · Γ1):甘油60,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉3,硫酸銨2,調 整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0104] 實施例6假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01發酵產胞外多糖
[0105]將28 °C培養1.5天的菌種斜面接種液體種子培養基，28°C培養10小時，按體積比 10%的接種量接入到搖瓶發酵培養基中，28°c培養72小時，結束發酵。稱取lg發酵產物，加 水稀釋150倍，苯酚硫酸法測定的胞外多糖產率為11.85g/L。
[0106] 發酵用液體種子培養基組成(g/L)甘油20,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉6,硫酸 銨2，調整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0107] 發酵用培養基組成(g · L-1):甘油80,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉5,硫酸銨1，調 整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0108] 應當理解的是，本發明的上述【具體實施方式】僅僅用于示例性說明或解釋本發明的 原理，而不構成對本發明的限制。因此，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下所做的任何 修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。此外，本發明所附權利要求旨 在涵蓋落入所附權利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內的全部變化和修 改例。
【主權項】
1. 一種微生物胞外多糖的制備方法，包括： 1) 利用保藏編號為CCTCC No:M2016035的假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01發酵至 發酵液呈凝膠狀，得胞外多糖發酵液； 2) 將步驟1)得到的胞外多糖發酵液加水稀釋，離心，收集上清液，真空濃縮至原體積， 加乙醇進行醇沉，收集沉淀干燥后即獲得胞外多糖粗品。2. 根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，步驟1)中假單胞菌 (Pseudomonas sp. )SFEP_01發酵的方法包括步驟如下： ① 將假單胞菌SFEP-01接種于新鮮斜面菌種培養基上，25-30°C培養1-2天得活化菌體； ② 將步驟①制得的活化菌體接種于液體種子培養基中，25-30Γ培養8-24小時，得種子 液； ③ 將步驟②制得的種子液接種至發酵培養基，25-30°C發酵48 - 72小時至發酵液呈凝 膠狀，得胞外多糖發酵液。3. 根據權利要求2所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，斜面菌種培養基為(g/L): 葡萄糖20-50，酵母浸粉2-5，氯化鈉2-5，瓊脂粉15-20，pH值調至7.0-7.2; 液體種子培養基為(g/L):碳源10-60,酵母浸粉3-6,氯化鈉2-5,玉米漿粉3-5,硫酸銨 1-2,調整pH 值 7.0-7.2; 發酵培養基為(g/L):碳源40-80，酵母浸粉3-6，氯化鈉5-8，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2， 調整 pH 值 7.0-7.2。4. 根據權利要求2所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，液體種子培養基和產胞外 多糖發酵培養基中，碳源可選甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、檸檬酸鹽等，優選為甘油。5. 根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，步驟2)中，發酵液加水稀 釋10-50倍，4000-8000r/min離心10-20min，收集上清液然后再40-60 °C濃縮至原發酵液體 積，加入1-3倍無水乙醇，充分混勻，靜置沉淀，然后再經3000-5000r/min離心或過濾收集沉 淀，低溫干燥或冷凍干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗品。6. 根據權利要求1所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，還包括： 步驟3)取步驟2)制取的胞外多糖粗品，加緩沖液分散，經DEAE-Sepharose Fast Flow 離子交換柱分離，得到EPS I和EPS Π 兩個組分，分別收集EPS I和EPS Π 適當濃縮后再分 別用葡聚糖凝膠G-100柱層析，獲得SFEP-01菌株胞外多糖組分EPS I和EPS Π 純品。7. 根據權利要求6所述的胞外多糖的制備方法，其特征在于，胞外多糖粗品，加300-500 倍緩沖液溶解分散形成膠體溶液； DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離條件為:將離子膠DEAE-Sepharose Fast Flow濕裝柱，用0 · 05mol/L、pH為7 · 6的Tris-HCl溶液平衡，將粗多糖樣品用0 · 05mol/L、pH為 7.6Tris-HCL緩沖液溶解分散溶解后上樣，用1.2mol/L的氯化鈉溶液進行線性梯度洗脫，洗 脫的流速為1-1.5BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，繪制洗脫曲線，合并單一 峰收集管，透析、濃縮用于后續分離； 葡聚糖凝膠G-100柱分離條件為:將葡聚糖凝膠G-100濕裝柱，用0.05mol/L、pH為7.6的 Tris-HCL溶液平衡，將DEAE-Sepharose Fast Flow分離的單一組分濃縮上樣，用相同的緩 沖液洗脫，洗脫流速l_2BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，合并收集到的多糖 含量高的收集管，透析、濃縮、干燥。8.根據權利要求1-7任一項制備方法制備得到的胞外多糖。
【專利摘要】本發明公開了一種微生物胞外多糖及其制備方法，利用假單胞菌(Pseudomonas？sp.)SFEP-01進行胞外多糖的制備，發酵胞外多糖產率可達8-12g/L，所產胞外多糖具有極強的凝膠活性、抗氧化活性、還原能力和清除超氧陰離子自由基的能力，該菌株所產胞外多糖主要含有兩種成分：EPS？Ⅰ和EPS？Ⅱ，EPS？Ⅰ為雜多糖，單糖殘基為葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，EPS？Ⅱ為均一多糖，單糖殘基為葡萄糖；所述菌株已于2016年1月14日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC？No:M2016035。所述菌株和多糖均具有良好研究開發前景。CCTCC NO：M201603520160114
【IPC分類】C12P19/04
【公開號】CN105647990
【申請號】
【發明人】劉建軍, 趙祥穎, 田延軍, 趙晨, 張家祥, 王曉霞
【申請人】山東省食品發酵工業研究設計院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月14日