-1.5BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，繪制洗脫曲線， 合并單一峰收集管，透析、濃縮用于后續分離。
[0040] 葡聚糖凝膠G-100柱分離條件為:將葡聚糖凝膠G-100濕裝柱，用0.05mol/L、pH為 7.6的Tris-HCL溶液平衡，將DEAE-Sepharose Fast Flow分離的單一組分濃縮上樣，用相同 的緩沖液洗脫，洗脫流速l_2BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，合并收集到的 多糖含量高的收集管，透析、濃縮、干燥得到EPS I和EPS Π 純品。
[0041 ] 分別對EPSI和EPS Π 進行酸水解，水解產物通過紙層析和HPLC分析顯示，EPSI水解 產物含有葡萄糖、甘露糖、鼠李糖三種成分(見附圖6)，EPS Π 水解產物中只有葡萄糖(見附 圖7)。
[0042]經檢測SFEP-01菌株胞外多糖具有抗氧化活性，還原能力和清除超氧陰離子自由 基的能力與維生素 C相當。
[0043]本發明取得了以下有益效果：
[0044] (1)本發明利用分離獲得的假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP-01進行胞外多糖的 制備，利用甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉等可發酵產生凝膠型胞外多糖，經發酵條件適當優化 后，SFEP-01菌株發酵胞外多糖產率可達8-12g/L;
[0045] (2)本發明進一步分離純化了假單胞菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01胞外多糖的組 分，該菌株所產細菌胞外多糖經鑒定主要含有兩種成分:EPSI和EPSII，EPSI為雜多糖，單糖 殘基為葡萄糖、甘露糖和鼠李糖，EPS Π 為均一多糖，單糖殘基為葡萄糖；
[0046] (3)本發明利用獲得的假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP_01生產的胞外多糖具有 抗氧化活性，還原能力(見圖8)和清除超氧陰離子自由基的能力(見圖9)與維生素 C相當。
【附圖說明】
[0047]圖1假單胞桿菌SFEP-01菌株在平板上的培養24小時的菌落特征。
[0048]圖2假單胞桿菌SFEP-01菌株在平板上的培養48小時的菌落特征。
[0049] 圖3假單胞桿菌SFEP-01菌株在液體培養基中培養12小時的菌體特征。
[0050] 圖4假單胞桿菌SFEP-01菌株在液體培養基中培養24小時的菌體特征。
[0051 ] 圖5假單胞桿菌SFEP-01菌株產胞外多糖經DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換 柱分離洗脫曲線。
[0052]圖6假單胞桿菌SFEP-01菌株所產胞外多糖EPSI水解后HPLC譜圖。
[0053]圖7假單胞桿菌SFEP-01菌株所產胞外多糖EPS Π 水解后HPLC譜圖。
[0054]圖8假單胞桿菌SFEP-01菌株所產胞外多糖粗品及EPSI、EPSII還原能力的測定 [0055]圖9假單胞桿菌SFEP-01菌株所產胞外多糖粗品及EPSI、EPSII清除超氧陰離子自 由基的能力的測定
【具體實施方式】
[0056]實施例1菌株的分離
[0057] 發明人在進行海洋真菌發酵生產DHA的過程中發現染菌現象，逐進行污染菌種分 離，獲得SFEP-01菌株，進一步研究發現該菌株可以利用常見碳源產生大量胞外多糖，經生 理生化鑒定和16S rDNA測序分析，鑒定該菌株為假單胞菌(Pseudomonas sp.)。
[0058] 實施例2碳源對假單胞菌SFEP-01菌株產細菌胞外多糖的影響
[0059]將28°C培養1-2天的菌種斜面接種液體種子培養基，28°C培養14小時，按體積比 5%的接種量接入到添加不同碳源的搖瓶發酵培養基中，28°C培養68小時，結束發酵。稱取 lg發酵產物，加水稀釋150倍，稀釋液采用苯酚硫酸法測定的胞外多糖產率。SFEP-01菌株利 用不同碳源胞外多糖的產量見表2.
[0060] 表2碳源對SFEP-01菌株產胞外多糖的影響
[0061]
[0062]斜面培養基組成為（g/L):葡萄糖2,蛋白胨10,牛肉膏5,氯化鈉3,瓊脂20,調整 pH7.0-7.2,蒸餾水配制。
[0063]發酵用液體種子培養基組成（g/L)葡萄糖20,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉6,硫 酸銨2，調整pH值7.0-7.2，自來水配制。
[0064]發酵培養基組成(g · Γ1):碳源60,酵母浸粉5,氯化鈉3,玉米漿粉3,硫酸銨2,調整 pH值7.0-7.2,自來水配制。。
[0065]實施例3假單胞菌SFEP-01發酵胞外多糖的分離純化及定性鑒定 [0066]利用SFEP-01菌株發酵生產細菌胞外多糖的方法：
[0067] 取25-30 °C培養1-2天的新鮮斜面接種液體種子培養基，25-30 °C培養8-24小時，接 種搖瓶發酵培養基，25-30°C搖瓶發酵48 - 72小時至發酵液呈凝膠狀。適量稱取發酵產物 (因為發酵結束時，發酵液呈凝膠狀，因此取樣采用稱重方式），采用苯酚硫酸法測定其多糖 含量。
[0068] SFEP-01菌株產細菌胞外多糖的粗多糖的制取：
[0069] 發酵結束后，發酵液(呈凝膠狀)加水稀釋10-50倍，4000-8000r/min離心10min，收 集上清液然后再濃縮至原發酵液體積，加入3倍無水的乙醇，充分混勻，靜置沉淀，然后再經 3000-5000r/min離心或過濾收集沉淀，低溫干燥或冷凍干燥即得SFEP-01菌株胞外多糖粗 品。
[0070] 假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01斜面菌種培養基為(g/L):葡萄糖20-50， 酵母浸粉2-5，氯化鈉2-5，瓊脂粉15-20。pH值調至7.0-7.2。
[0071] 假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP_01液體種子培養基為(g/L):碳源10-60,酵 母浸粉3-6，氯化鈉2-5，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2，調整pH值7.0-7.2。
[0072] 假單胞桿菌(Pseudomonas sp. )SFEP-〇l產胞外多糖發酵培養基為(g/L):碳源40- 80，酵母浸粉3-6，氯化鈉5-8，玉米漿粉3-5，硫酸銨1-2，調整pH值7.0-7.2。
[0073] 假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01液體種子培養基和產胞外多糖發酵培養 基中，碳源可選甘油、葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、檸檬酸鹽等，優選為甘油。
[0074] 假單胞桿菌(Pseudomonas sp.)SFEP-01所產細菌胞外多糖分離純化及定性鑒定：
[0075]取按上述方法制取的SFEP-01菌株所產細菌胞外多糖粗品，加300-500倍緩沖液溶 解溶解分散形成膠體溶液，經DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離，得到兩個組分 EPSI和EPSII(見附圖5)，分別收集EPSI和EPSII適當濃縮后再分別用葡聚糖凝膠G-100柱層 析，結果仍為單一組分。將收集的EPSI和EPSΠ ，分別進行酸水解，水解產物通過紙層析和 HPLC分析顯示，EPSI水解產物含有葡萄糖、甘露糖、鼠李糖三種成分(見附圖6 )，EPS Π 水解 產物中只有葡萄糖(見附圖7)。
[0076] DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離條件為：將離子膠DEAE-Sepharose Fast Flow濕裝柱，用0.05mol/L、pH為7.6的Tris-HCl溶液平衡。將粗多糖樣品用0.05mol/ L、pH為7.6Tris-HCL緩沖液溶解分散溶解后上樣，用1.2mol/L的氯化鈉溶液進行線性梯度 洗脫，洗脫的流速為1-1.5BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，繪制洗脫曲線， 合并單一峰收集管，透析、濃縮用于后續分離。
[0077]葡聚糖凝膠G-100柱分離條件為:將葡聚糖凝膠G-100濕裝柱，用0.05mol/L、pH為 7.6的Tris-HCL溶液平衡，將DEAE-Sepharose Fast Flow分離的單一組分濃縮上樣，用相同 的緩沖液洗脫，洗脫流速l_2BV/hr，每管收集5mL，檢測收集管中的多糖含量，合并收集到的 多糖含量高的收集管，透析、濃縮、干燥，用于多糖水解定性分析。
[0078] SFEP-01菌株發酵液中多糖含量以及柱層析收集液中的多糖含量的采用苯酚硫酸 法測定，具體操作方法參考《復合多糖生化研究技術》(張惟杰.復合多糖生化研究技術[M]. 上海:上海科學技術出版社.1987. )p6。
[0079] EPSI和EPSII酸水解方法參考《復合多糖生化研究技術》(張惟杰.復合多糖生化研 究技術[M].上海:上海科學技術出版社.1987. )pl57
[0080] 水解產物紙層析分析方法參考《復合多糖生化研究技術》(張惟杰.復合多糖生化 研究技術[M].上海:上海科學技術出版社.1987. )ρ10
[0081 ] 水解產物HPLC分析方法:進樣濃度110-50g/L。色譜柱:Hypersil APS-2(4.6mmX 250mm，5μηι);流動相：乙腈:水= 80:20(V/V);流速:0 · 5mL/min;進樣量：1 OuL;柱溫：30 °C。 [0082] 實施例4假單胞菌(Pseudomonas sp.)SFEP_01產胞外多糖的制備 [0083]將28°C培養1-2天的菌種斜面接種液體種子培養基，28°C培養14小時，按體積比 5%的接種量接入到添加不同碳源的搖瓶發酵培養基中，28°C培養68小時，結束發酵。收集 發酵液(凝膠狀)約1L，苯酚硫酸法測多糖含量為10.85g/L，加水稀釋50倍，6000r/min離心 lOmin，收集上清液然后再濃縮至原發酵液體積約1L，加入3倍95%的乙醇，充分混勻，靜置 沉淀，然后再經3000-5000r/min離心，收集沉淀，冷凍干燥，得胞外多糖粗品8.32g。
[0084] 取上述制取的細菌胞外多糖粗品，加300倍緩沖液溶解分散，分次（每次上樣量 20ml)上樣過DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離（3.5 X40)，用1 · 2mol/L的氯化鈉 溶液進行線性梯度洗脫，洗脫的流速為1.5BV/hr，5