擬南芥糖基轉移酶ugt79b2在催化合成花青素鼠李糖苷中的應用
【技術領域】
[00011本發明涉及一種糖基轉移酶的應用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉移酶UGT79B2在 合成花青素鼠李糖苷中的應用;屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 花青素是植物體內一種非常重要的小分子物質，它對植物的生長發育有重要的調 節控制作用。花青素是一種水溶性的花色素，在植物體內積累能夠增加植物體對UV-B輻射 和抗紫外，還能影響植物的花色。花青素有很多活躍的羥基，能夠與各種糖類物質的羧基結 合，失去一份子的水分，從而形成花青素的糖苷。目前鼠李糖的花青素糖苷常作為標準品被 用在花青素糖基化修飾和人類保健等科學研究中。但是目前人們對鼠李糖花青素糖苷的獲 得主要是通過植物提取和化學合成的方法，從植物體內提取，很難分離到比較純的目的糖 苷，同時化學合成的方法，又比較費時費力。相比之下，生物酶法合成花青素鼠李糖苷則具 有尚效尚廣等優點。
[0003] 植物體內有一類酶，被稱為糖基轉移酶，它們能將各種糖基轉移到小分子上，從而 改變小分子的生物活性。能被糖基化的小分子有植物激素、次生代謝物、多肽、蛋白、病原菌 侵染物以及植物的內源和外源毒性物質。但檢索發現:到目前為止，人們還沒有找到一個糖 基轉移酶，能夠轉移鼠李糖到花青素分子上，有關合成花青素鼠李糖苷的糖基轉移酶的文 獻還未有報道。
【發明內容】
[0004] (1)本發明的目的
[0005] 針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種擬南芥糖基轉移酶UGT79B2在合 成花青素鼠李糖苷中的應用。
[0006] (2)發明的技術方案
[0007] 本發明所述的擬南芥糖基轉移酶UGT79B2在以鼠李糖為糖供體，催化花青素 (cyanidin)和3-0 glucose花青素（3-〇-glucose cyanidin)合成花青素鼠李糖苷中的應 用。
[0008] 其中：
[0009] 所述擬南芥糖基轉移酶基因 UGT79B2的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示，所述擬南 芥糖基轉移酶UGT79B2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。該糖基轉移酶是通過糖基轉移酶 基因 UGT79B2在大腸桿菌中表達和純化后獲得的。糖基轉移酶基因 UGT79B2是通過RT-PCR方 法從擬南芥中克隆獲得。
[0010] 上述花青素是指花青素 （Cyanidin )和3-0葡萄糖花青素（3-0-glucose cyanidin)〇
[0011] 實驗證實，將本發明公開的擬南芥糖基轉移酶UGT79B2與花青素和3-0葡萄糖花青 素放于反應管中，按實施例2中所給出的條件進行酶促反應，即可催化合成相應的糖苷。其 與已經報道的其它糖基轉移酶不同的是，本發明所述糖基轉移酶UGT79B2能專一性的轉移 鼠李糖。
[0012] (3)本發明實施后可能帶來的有益效果
[0013]本發明在國內外首次公開了擬南芥糖基轉移酶UGT79B2在以鼠李糖為糖供體，催 化花青素(cyanidin)和3-0 glucose花青素(3-0-glucose cyanidin)合成花青素鼠李糖苷 中的應用。本發明的公開為通過體外酶催化的方法合成花青素的鼠李糖糖苷提供條件，實 現了高效、專一性的合成鼠李糖花青素糖苷(見附圖2至附圖5)，克服了用提取方法或化學 合成方法獲得鼠李糖花青素糖苷物效率低下，費時費力的不足。本發明實施后將為花青素 鼠李糖糖苷合成工業帶來巨大經濟效益。
【附圖說明】
[0014] 圖1.純化的融合蛋白GST-UGT79B2用SDS-PAGE檢測。
[0015] 其中，Μ為蛋白質分子量標記;序號1泳道為GST標簽蛋白，作為對照;序號2泳道為 純化的GST-UGT79B2融合蛋白。
[0016] 圖2.純化后的融合蛋白GST-UGT79B2催化花青素形成糖苷，催化產物用高效液相 色譜(HPLC)分析。
[0017] 其中1為對照組，純化的GST標簽蛋白與花青素和UDP-鼠李糖的反應體系，無糖苷 合成;2為實驗組，純化的GST-UGT79B2融合蛋白與花青素和UDP-鼠李糖的反應體系，比只含 有GST標簽蛋白的對照反應體系多出一個明顯的產物峰(箭頭b所指），該產物被推測為花青 素糖苷，圖中的a為花青素。
[0018] 圖3.花青素的催化產物用質譜(LC-MS)鑒定。
[0019] 圖中表示花青素的催化產物（圖2中的peak b)的質譜分析結果，圖中主要的離子 峰符合花青素鼠李糖苷的離子峰特征，證明花青素在酶的催化下形成了鼠李糖糖苷。
[0020] 圖4.純化后的融合蛋白GST-UGT79B2催化3-0葡萄糖花青素形成鼠李糖糖苷，催化 產物用高效液相色譜(HPLC)分析。
[0021] 其中1為對照組，純化的GST標簽蛋白與3-0葡萄糖花青素和UDP-鼠李糖的反應體 系，無糖苷合成；2為實驗組，純化的GST-UGT79B2融合蛋白與3-0葡萄糖花青素和UDP-鼠李 糖的反應體系，比只含有GST標簽蛋白的對照反應體系多出一個明顯的產物峰（箭頭b所 指），該產物被推測為花青素鼠李糖糖苷，圖中的a為花青素。
[0022] 圖5.3-0葡萄糖花青素的催化產物用質譜(LC-MS)鑒定。
[0023] 圖中表示3-0葡萄糖花青素的催化產物（圖4中的peak b)的質譜分析結果，圖中主 要的離子峰符合3-0葡萄糖花青素鼠李糖苷的離子峰特征，證明3-0葡萄糖花青素在酶的催 化下形成了鼠李糖糖苷。
【具體實施方式】
[0024]實施例1擬南芥糖基轉移酶基因 UGT79B2的克隆、原核表達與酶蛋白純化 [0025] 1.擬南芥糖基轉移酶基因 UGT79B2的克隆
[0026] 通過公開網站http: //www · cazy · org獲得UGT79B2基因的cDNA序列。根據cDNA序列 設計引物，正向引物為79B2-F: 5 ' -GGATCCCAGAAATGGGTGGTTTGAAGTTTC-3 '，反向引物為 79B2-R: 5 ' -GAGCTCTACCAACCTTATTGATCACTCCCT-3 '。利用TRI zol試劑盒提取擬南芥RNA，RT-PCR方法擴增UGT79B2基因的全長cDNA序列。將cDNA克隆的過程是先經過BamHI和SacI酶切， 之后連入相應酶切的pBluescript II SK( + )載體中，構建成測序中間載體，稱為pK79B2,然 后用載體進行基因全長PCR擴增