肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法
【專利說明】
[0001 ]本申請是分案申請，其原申請的國際申請號是PCT/JP2012/079182，國際申請日是 2012年11月9日，中國國家申請號為201280050798.X，進入中國的日期為2014年4月16日，發 明名稱為"肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法"。
技術領域
[0002] 本發明涉及基因重組技術在肌肉肌醇的制造中的應用。特別是涉及利用原核微生 物的轉化體的肌肉肌醇的工業制造方法。本發明進一步涉及新穎的肌肉肌醇衍生物及其制 造方法。
【背景技術】
[0003] 肌肉肌醇對于多數高等動物來說為必不可缺的物質，因而其作為營養食品、飼料、 藥品等成分廣泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪和膽固醇類的代謝中發揮出重要的作用， 在高膽固醇血癥等的預防或治療中是特別有效的。因而，對于以工業規模制造肌肉肌醇的 制造工藝提出了多種改良方案。
[0004] 以往，肌肉肌醇是從米糠、玉米漿等直接提取的，但該提取方法中，肌肉肌醇的收 率低，并且大量生成雜質，因而肌肉肌醇的精制困難，生產效率極低。因此，還有人提出了對 具有肌肉肌醇生產能力的面包酵母進行培養，由該培養物中生成肌肉肌醇的方法，但該方 法的生產率仍然較低，在經濟上不成立，因而未進行工業實施。
[0005] 因而，對更加有效地生產肌醇的微生物進行了檢索。專利文獻1公開了可向菌體外 分泌肌醇的假絲酵母屬酵母的表達及其利用。專利文獻2和3分別公開了在上述假絲酵母屬 酵母中導入可賦予針對葡萄糖代謝抵抗物質和抗生素的耐性的突變的內容。另外，在專利 文獻4、5和6中還分別公開了通過在具有肌醇生產能力的假絲酵母屬酵母中導入可賦予針 對叔胺、六氯環己烷和十六烷基三甲基銨鹽的耐性的突變來提高肌醇的收率的內容。專利 文獻7中同樣公開了在具有肌醇生產能力的假絲酵母屬酵母中導入可賦予針對6-鹵代-6-脫氧葡萄糖的耐性的突變的內容。在專利文獻8中還公開了在具有肌醇生產能力的假絲酵 母屬酵母中導入可賦予針對鹵化乙酰甲酸的耐性的突變的內容。
[0006] 進一步地，現有技術還記載了利用基因重組進行的酵母的轉化。在專利文獻9中公 開了下述內容:在一系列的肌肉肌醇生物合成反應中，肌醇-1-磷酸合成酶承擔控速反應， 在這一恰當推論下，通過單獨利用編碼上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA對不具有肌醇分泌能 力的假絲酵母屬酵母進行轉化而對該酵母賦予肌醇生產能力。在專利文獻10中公開了通過 將置于甘油-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的調節下的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的DNA單獨導入 酵母，來提高該酵母的肌醇生產率的內容。
[0007] 進一步地，專利文獻11中還涉及甲醇利用性酵母畢赤酵母進行肌醇生產的內容， 其中公開了在該酵母中導入肌肉肌醇-1-磷酸合成酶基因并同時導入肌醇磷酸磷酸酯酶基 因的內容，但未明確該追加的肌醇磷酸磷酸酯酶基因導入的意義和效果。
[0008] 因而，關于上述酵母的任一文獻均是以在一系列的肌肉肌醇生物合成反應中肌 醇-1-磷酸合成酶承擔控速反應為前提的，并未暗示存在于肌肉肌醇生物合成通路中的除 此以外的酶的重要性。
[0009] 另一方面，對于以大腸桿菌為代表的原核微生物，由于其旺盛的增殖能力及發酵 管理中的各種優越性，與酵母相比，其為極富魅力的工業生產用生物。但是，具有內源性肌 肉肌醇生物合成通路的原核微生物尚不為人所知。
[0010] 因而，為了利用原核微生物進行肌肉肌醇的工業生產，在原核微生物宿主內構建 外來性的肌肉肌醇生物合成通路為不可缺的。
[0011] 具體地說，為了在原核微生物宿主內構建功能性肌肉肌醇生物合成通路，下述催 化劑活性為必要的：
[0012] 活性1:由適當的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性；
[0013] 活性2:將葡萄糖-6-磷酸轉換為肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶 活性;和
[0014] 活性3:以肌肉肌醇-1-磷酸為底物的磷酸酯酶活性。
[0015] 但是，由于作為活性1的生成物的葡萄糖-6-磷酸為原核微生物普遍產生的代謝中 間體，因而對原核微生物賦予該活性并非為必須的。此外，對于活性3來說，就本發明人所 知，大多數適于通過現有的基因重組方法進行工業生產的原核微生物宿主細胞表達內源性 肌醇單磷酸酶、或者具有能夠以肌肉肌醇-1-磷酸為底物的通用單磷酸酶活性。此外，若對 活性2進行觀察，則多為原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例。并且，如上所 述，在肌肉肌醇生物合成反應中，認為肌醇-1-磷酸合成酶承擔控速反應。因而，為了在原核 微生物宿主內構建功能性肌肉肌醇生物合成通路，認為在該細胞中導入肌醇-1-磷酸合成 酶基因是充分必要的。
[0016] 實際上，非專利文獻1公開了肌肉肌醇在大腸桿菌轉化體內的生產，但僅在該轉化 體中導入了肌醇-1-磷酸合成酶基因。
[0017] 專利文獻12中還公開了在大腸桿菌宿主細胞中僅導入肌醇-1-磷酸合成酶基因來 制作轉化體、由此在該轉化體內構建外來性肌肉肌醇生物合成通路的內容。但是，該文獻的 最終目的生成物為D-葡糖二酸，肌肉肌醇是作為中間體生產的。特別要指出的是，該文獻中 還記載了下述內容："還應該注意到，本發明中的suhB基因或相同的磷酸酯酶并未過剩表 達。但是，在培養產物中未檢測出肌肉肌醇-1-磷酸，另一方面卻蓄積了肌肉肌醇。因而發明 人得出結論，磷酸酯酶活性并未限制通過通路的代謝流(flux)。"（第33頁、第2~5行）。
[0018] 因而，現有技術并未公開或暗示肌醇單磷酸酶在通過重組微生物進行肌肉肌醇生 產中的決定性作用。
[0019] 現有技術文獻
[0020] 專利文獻
[0021] 專利文獻1:日本特開平8-00258號公報 [0022] 專利文獻2:日本特開平8-38188號公報 [0023] 專利文獻3:日本特開平8-89262號公報 [0024] 專利文獻4:日本特開平9-117295號公報 [0025] 專利文獻5:日本特開平10-42860號公報 [0026] 專利文獻6:日本特開平10-42882號公報
[0027] 專利文獻7:日本特開平10-42883號公報
[0028] 專利文獻8:日本特開2000-41689公報
[0029] 專利文獻9:日本特開平9-220093號公報
[0030] 專利文獻10:日本特開平10-271995號公報
[0031] 專利文獻11:日本特開2011-55722號公報
[0032] 專利文獻12:W02009/145838號小冊子
[0033]非專利文獻
[0034] 非專利文獻1:J. Am. Chem.Soc. 1999，Vol. 121,3799-3800
【發明內容】
[0035] 發明所要解決的課題
[0036] 對于不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的微生物，通過使用與基因重組技術聯 合的合成生物學方法，其具有容易調節肌肉肌醇生產率的優點。特別是大腸桿菌等原核微 生物宿主除了不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路以外，還不具有多數酵母所具有的肌醇 同化能力（分解能力），因而更容易應用合成生物學的方法。此外，對于大腸桿菌來說，由于 其迅速的生長能力及發酵管理的容易性，從工業發酵生產的方面考慮其是極富魅力的，同 時從應用基因重組技術時的實際成績、確定的安全性的方面出發也具有優點。
[0037] 因而，本發明所要解決的課題在于對不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物賦予顯著得到改善的肌肉肌醇和相關衍生物的生產能力。
[0038]解決課題的手段
[0039] 如上所述，在迄今為止的任一研究中，均暗示了肌醇-1-磷酸合成酶在肌肉肌醇生 物合成反應中承擔控速反應的內容。并且，在任一研究中均未對肌醇單磷酸酶活性予以特 別關注。
[0040] 但是，本發明人令人吃驚地發現，在不具有內源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物內導入肌肉肌醇生物合成通路而得到的轉化體中，肌醇單磷酸酶活性具有重大的作 用。出人預料地，通過增強肌醇單磷酸酶活性，這樣的轉化體的肌肉肌醇生產能力大幅提 高。本發明人進一步發現，在這樣的轉化體的培養物中表達出了新型的肌肉肌醇衍生物。
[0041] 因而，本發明的第1方面在于：
[0042] (1)-種肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：
[0043] 1)準備轉化體的工序，該轉化體為不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的 轉化體，其至少含有以能夠在該轉化體內表達的方式導入的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外 來基因，并且具有對該轉化體內的功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產或肌醇單磷酸酶的活化 進行誘導的基因重組或變異；以及
[0044] 2)在適于上述轉化體的生長和/或維持的條件下，使該轉化體與能夠由該轉化體 轉換為肌肉肌醇的碳源進行接觸的工序。
[0045] 更特定地說，上述制造方法為使用下述轉化體的肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制 造方法，該轉化體為具有以能夠表達的方式導入到不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微 生物內的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基因的轉化體，其特征在于，上述轉化體具有對功 能性肌醇單磷酸酶的過剩生產或肌醇單磷酸酶的活化進行誘導的基因重組或變異。
[0046] 上述(1)的培養物中生產的肌肉肌醇衍生物為新穎的化合物，在該衍生物中，葡萄 糖與肌肉肌醇呈β1-4鍵合。因而，本發明的一個方式為：
[0047] (2)如上述（1)所述的制造方法，其中，上述肌肉肌醇衍生物為下述結構式所表示 的化合物：
[0048] [化1]
[0049]
[0050] 前面已經對合成生物學方法的應用和發酵生產中的原核微生物、特別是大腸桿菌 的優點進行了敘述。因而，本發明的適宜方式包括：
[0051] (3)如上述（1)或（2)所述的制造方法，其中，上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成 酶的微生物為原核生物；
[0052] (4)如上述（1)或（3)的任一項所述的制造方法，其中，上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物為具有內源性肌醇單磷酸酶基因的微生物；
[0053] (5)如上述（1)或（4)的任一項所述的制造方法，其中，上述不表達內源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物為選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細菌、棒狀桿菌屬細菌、發酵單胞菌屬 細菌組成的組中的細菌；以及
[0054] (6)如上述(5)所述的制造方法，其中，上述細菌為大腸桿菌。
[0055] 無論宿主微生物是否具有內源性肌醇單磷酸酶活性，通過在該細胞內過剩生產肌 醇單磷酸酶，可增強該細胞的肌醇單磷酸酶活性。可應用各種公知的技術進行肌醇單磷酸 酶的過剩生產。因而，本發明包括以下的方式：
[0056] (7)如上述（1)或(6)的任一項所述的制造方法，其中，上述肌醇單磷酸酶的過剩生 產是通過對上述微生物進行下述操作而誘導的：
[0057] a)導入外來肌醇單磷酸酶基因；
[0058] b)增加內源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數；
[0059] c)在內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域導入變異；
[0060] d)利用高表達誘導性外來調節區域來置換內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域； 或者
[0061] e)使內源性肌醇單磷酸酶基因的調節區域缺失；以及
[0062] (8)如上述(7)所述的制造方法，其中，上述肌醇單磷酸酶的過剩生產是通過對上 述微生物導入外來肌醇單磷酸酶基因而誘導的。
[0063] 此外，在宿主細胞具有內源性肌醇單磷酸酶基因的情況下，也可利用下述方式來 增強該細胞的肌醇單磷酸酶活性。
[0064] (9)如上述（1)或(6)的任一項所述的制造方法，其中，上述肌醇單磷酸酶的活化是 通過對上述微生物進行下述操作而誘導的：
[0065] f)在內源性肌醇單磷酸酶基因中導入變異；
[0066] g