和BamHI和SacI酶切驗證，最后進行序列測定，驗證克隆序 列的正確性。
[0027] 2.UGT79B2的序列信息與特性
[0028] 對克隆的糖基轉移酶基因 UGT79B2測序后發現，該基因的編碼區cDNA為1368bp，編 碼455個氨基酸的50.6kDa蛋白，C端具有44個氨基酸的PSPG盒，為植物次生代謝物糖基轉移 酶所共同具有的保守序列。
[0029] 3.擬南芥糖基轉移酶基因 UGT79B2的原核表達載體構建
[0030] 在公開通用的原核表達載體PGEX-2T的基礎上，按照《分子克隆》（Sambrook等編 著)所示的方法，對該載體進行改造，使其多克隆位點包含BamHI和SacI。用BamHI和SacI雙 酶切該表達載體，回收載體片段備用。同時用BamHI和SacI雙酶切前述載體pK79B2，回收得 到目的基因片段，并將其連入上述原核表達載體中，得到擬南芥糖基轉移酶基因 UGT79B2的 原核表達載體PGEX-79B2。
[0031] 4.轉化大腸桿菌、誘導蛋白表達及酶蛋白的純化
[0032] 將上述原核表達載體pGEX-79B2轉化大腸桿菌菌株XLl-Blue，PCR和酶切驗證正確 后，保存菌種，此菌種用于融合蛋白（GST-UGT79B2)的表達純化。
[0033]在添加了氨芐青霉素（100mg/L)的2XYT液體培養基中過夜培養上述菌種，以活化 該菌種。然后將過夜培養物按照1:100 (過夜培養物:新的2 X YT液體培養基）的比例擴大至 75ml培養液中，37°C培養至0D600 = 0.8。然后加入IPTG至0.2mM，轉到20°C震蕩培養24h以誘 導目的蛋白表達。到時間后通過離心收集菌體。
[0034]菌體加入2ml Blast BufTer(0 · 5mM EDTA，750mM鹿糖，200mM Tris-HCl，pH=8 · 0) 重懸，立即加入14ml稀釋的（1/2X )Blast Buffer(事先添加2mg溶菌酶），混勾后于冰上放 置30min，離心收集菌體，用PBS(內含0.2mM的PMSF)重懸，冰上放置30min后lOOOOrpm離心 20min，取上清。在上清中加入100μ1的谷胱甘肽瓊脂糖珠子，按照pGEX蛋白純化手冊操作， 最后用Elution Buffer(50mM Tris-HCl，10mM還原型谷胱甘肽，pH=8.0)洗脫目的蛋白。目 的蛋白的純度用SDS-PAGE方法檢測，蛋白濃度按照Bradford試劑盒說明書中的方法進行測 定(用BSA作為蛋白標準）。
[0035]實施例2擬南芥糖基轉移酶UGT79B2催化花青素鼠李糖苷的合成 [0036] 1.花青素的酶催化反應
[0037]用純化到的擬南芥糖基轉移酶UGT79B2的融合蛋白（GST-UGT79B2,能夠反映 UGT79B2的催化活性，屬于常用的做法)進行體外的酶催化反應，選擇花青素和3-0葡萄糖花 青素作為底物，糖供體有 UDP-Glucose，UDP_xylose，UDP_arabinose，UDP_rhamnose，UDP_ galactose，UDP_glucuronic acid。
[0038]酶促反應體系如下： Tris-HCI CpH=7.0) 50 mM MgS〇4 2.5 mM KC! lOmM
[0039] UDP-I),'! 1.25 mM 花青素 1 mM 糖基轉移酶 1~ dd Η2Ο up to 200μ1
[0040] 將以上混合好的反應體系放于30°C恒溫水浴鍋中，反應3小時。然后加入20μ1濃度 為240mg/ml的三氯乙酸終止反應。將反應管用液氮速凍后存放在-20°C，直到HPLC分析。 [0041 ] 2.酶催產物的HPLC鑒定
[0042]用高效液相色譜(HPLC)分析以上的反應混合體系，所用的儀器為島津LC-20AT，柱 子為C18(Ultimate，4·6 X 150mm，5ym)，工作站為Ver 1 · 21，二極管陣列檢測器。流動相為乙 睛和水（均含有〇 . 1 %的三氟乙酸），二元高壓梯度洗脫，洗脫時間：Omin 90 %水項，20min 10 %水項，22min 90 %水項。HPLC分析顯示，與對照（反應體系中只含有純化的GST標簽蛋 白）相比，UGT79B2融合蛋白對2種花青素化合物都能催化合成相應的鼠李糖糖苷(見附圖2 和附圖4)，而不能催化形成其他的糖苷。
[0043] 3.酶催產物的質譜鑒定
[0044] 對酶催化產物進行LC-MS鑒定，儀器為Surveyor MSQ，所用的流動相為乙睛和水 (均含有0.1 %的甲酸），有機相梯度和洗脫時間同上述HPLC方法。
[0045]結果發現酶促反應生成的產物為各自花青素的鼠李糖糖苷產物(見附圖3和附圖 5)。由此得出結論:擬南芥糖基轉移酶UGT79B2可用于催化合成花青素的鼠李糖糖苷。
【主權項】
1. 擬南芥糖基轉移酶UGT79B2在以鼠李糖為糖供體，催化花青素（cyanidin)和3-0 glucose花青素 (3-0-glucose cyanidin)合成花青素鼠李糖苷中的應用。2. 如權利要求1所述的應用，其特征在于:所述擬南芥糖基轉移酶基因 UGT79B2的核苷 酸序列如SEQ ID No.l所示，所述擬南芥糖基轉移酶UGT79B2的氨基酸序列如SEQ ID No.2 所示。3. 如權利要求1所述的應用，其特征在于：所述花青素是花青素（cyanidin)和3-0 glucose花青素（3-〇-glucose cyanidin) 〇
【專利摘要】本發明公開了一種擬南芥糖基轉移酶UGT79B2在催化合成花青素鼠李糖苷中的應用；其中所述擬南芥糖基轉移酶UGT79B2的氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示，所述花青素是花青素(cyanidin)和3-O葡萄糖花青素(3-O-glucose？cyanidin)。實驗證實將本發明所述擬南芥糖基轉移酶UGT79B2與所述花青素放于反應管中進行酶促反應，即可催化合成相應的花青素鼠李糖糖苷。本發明的公開為利用酶催化方法高效、專一性地合成花青素鼠李糖苷物質提供了可行的方法，本發明實施后將為花青素鼠李糖苷合成工業帶來巨大經濟效益。
【IPC分類】C12P19/60
【公開號】CN105647998
【申請號】
【發明人】侯丙凱, 李攀, 李燕潔
【申請人】山東大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月22日