糖1%，pH約6. 8~7. 2， 30°C培養1~2天； 發酵培養基：熱炸黃豆餅粉1%，酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖3%，氯化鈉0. 5%，七水硫 酸鎂0· 2%，磷酸氫二鉀0· 1%，pH約6. 8~7· 2, 30°C培養2~3天； 將白色鏈霉菌基因工程菌株接種于種子培養基，30°C培養1~2天，然后按照發酵體積 的5%接種于發酵培養基，30°C培養2~3天； 發酵完成后，將發酵液過濾得到上清液，按照上清液體積的50%(w/v)加入硫酸銨，攪 拌6小時，溶液過濾收集沉淀，得到粗酶。
[0024] 實施例2棘白菌素 B底物轉化 在反應罐內配制磷酸鹽緩沖液1000L，含KH2P04 2 . 24g/L及Na2HP04 · 12H20 1. 24g/L， 用HC1調節pH約為6.0。
[0025] 將棘白菌素 B底物溶于甲醇中，濃度10%。
[0026] 控制反應罐溫度28~32°C，攪拌200rpm，初次向反應罐內投加粗酶30kg，并且緩慢 加入30L 10%的棘白菌素 B甲醇溶液使轉化反應液中棘白菌素 B含量為3kg，（即，棘白菌素 B含量（kg)相當于轉化反應液體積（L)的0.3%)，開始轉化。
[0027] 轉化4h后，向反應罐內投加粗酶10kg，并且緩慢加入30L 10%的棘白菌素 B甲醇 溶液； 轉化8h后，向反應罐內投加粗酶10kg，并且緩慢加入20L 10%的棘白菌素 B甲醇溶液； 轉化12h后，向反應罐內投加粗酶20kg，并且緩慢加入20L 10%的棘白菌素 B甲醇溶 液； 用HPLC監測棘白菌素 B底物及棘白菌素 B母核濃度，當棘白菌素 B底物濃度不再減少， 棘白菌素 B母核濃度不再增加，結束轉化，發酵液過濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素 B母 核含量，并計算棘白菌素 B的摩爾轉化率，為85% (摩爾轉化率％=生成ECBN摩爾數/底物 ECB摩爾數*100%)。過濾的沉淀主要為未轉化的棘白菌素 B底物，可回收并在下次轉化時 使用。
[0028] 實施例3棘白菌素 B底物轉化 在反應罐內配制磷酸鹽緩沖液3000L，含KH2P04 2 . 24g/L及Na2HP04 · 12H20 1. 24g/L， 用HC1調節pH約為6· 0 ; 將棘白菌素 Β底物溶于乙醇中，濃度10%; 控制反應罐溫度28~32°C，攪拌200rpm，初次向反應罐內投加粗酶120kg，并且緩慢加 入120L10%的棘白菌素 B乙醇溶液使轉化反應液中棘白菌素 B含量為12kg，開始轉化； 轉化6h后，向反應罐內投加粗酶30kg，并且緩慢加入90L 10%的棘白菌素 B乙醇溶液； 轉化12h后，向反應罐內投加粗酶30kg，并且緩慢加入90L 10%的棘白菌素 B乙醇溶 液； 轉化18h后，向反應罐內投加粗酶60kg，并且緩慢加入60L 10%的棘白菌素 B乙醇溶 液； 轉化24h后，向反應罐內投加粗酶30kg ; 用HPLC監測棘白菌素 B底物及棘白菌素 B母核濃度，當棘白菌素 B底物濃度不再減 少，棘白菌素 B母核濃度不再增加，結束轉化，發酵液過濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素 B母核含量，并計算棘白菌素 B的摩爾轉化率為80% (摩爾轉化率％=生成ECBN摩爾數/底 物ECB摩爾數*100%)。過濾的沉淀主要為未轉化的棘白菌素 B底物，可回收并在下次轉化 時使用。
[0029] 實施例4產棘白菌素 B脫酰酶菌株的發酵及粗酶制備 菌種：白色鏈霉菌（Streptomyces albus)，保藏號：ATCC21725 ;_80°C冷凍管保存； 種子培養基：熱炸黃豆餅粉〇. 5%，酵母粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，葡萄糖1%，pH約6. 8~7. 2， 30°C培養1~2天； 發酵培養基：熱炸黃豆餅粉1%，酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖3%，氯化鈉0. 5%，七水硫 酸鎂0· 2%，磷酸氫二鉀0· 1%，pH約6. 8~7· 2, 30°C培養2~3天； 將白色鏈霉菌基因工程菌株接種于種子培養基，30°C培養1~2天，然后按照發酵體積 的5%接種于發酵培養基，30°C培養2~3天； 發酵完成后，將發酵液過濾得到上清液，按照上清液體積的40%(w/v)加入氯化鈉，攪 拌6小時，溶液過濾收集沉淀，得到粗酶。
[0030] 實施例5棘白菌素 B底物轉化 在反應罐內配制磷酸鹽緩沖液1000L，含KH2P04 2 . 24g/L及Na2HP04 · 12H20 1. 24g/L， 用HC1調節pH約為5· 5 ; 將棘白菌素 Β底物溶于二甲基亞砜中，濃度5% ; 控制反應罐溫度28~32°C，攪拌200rpm，初次向反應罐內投加按照實施例4方法獲得的 粗酶l〇kg，并且緩慢加入40L 5%的棘白菌素 B的二甲基亞砜溶液使棘白菌素 B含量為2kg， 開始轉化； 轉化2h后，向反應罐內投加粗酶40kg，并且緩慢加入80L 5%的棘白菌素 B二甲基亞砜 溶液； 轉化8h后，向反應罐內投加粗酶30kg，并且緩慢加入60L 5%的棘白菌素 B二甲基亞砜 溶液； 轉化l〇h后，向反應罐內投加粗酶20kg，并且緩慢加入40L 5%的棘白菌素 B二甲基亞 砜溶液； 轉化12h后，向反應罐內投加粗酶10kg，并且緩慢加入20L 5%的棘白菌素 B二甲基亞 砜溶液； 轉化16h后，向反應罐內投加粗酶10kg ; 用HPLC監測棘白菌素 B底物及棘白菌素 B母核濃度，當棘白菌素 B底物濃度不再減 少，棘白菌素 B母核濃度不再增加，結束轉化，發酵液過濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素 B母核含量，計算棘白菌素 B的摩爾轉化率為87%。過濾的沉淀主要為未轉化的棘白菌素 B 底物，可回收并在下次轉化時使用。
[0031] 實施例6產棘白菌素 B脫酰酶菌株的發酵及粗酶制備 菌種：白色鏈霉菌（Streptomyces albus)，保藏號：ATCC21725 ;_80°C冷凍管保存； 種子培養基：熱炸黃豆餅粉〇. 5%，酵母粉0. 5%，蛋白胨0. 5%，葡萄糖1%，pH約6. 8~7. 2， 30°C培養1~2天； 發酵培養基：熱炸黃豆餅粉1%，酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖3%，氯化鈉0. 5%，七水硫 酸鎂0· 2%，磷酸氫二鉀0· 1%，pH約6. 8~7· 2, 30°C培養2~3天； 將白色鏈霉菌基因工程菌株接種于種子培養基，30°C培養1~2天，然后按照發酵體積 的5%接種于發酵培養基，30°C培養2~3天； 發酵完成后，將發酵液過濾得到上清液，按照上清液體積的80%(w/v)加入硫酸鈉，攪 拌6小時，溶液過濾收集沉淀，得到粗酶。
[0032] 實施例7棘白菌素 B底物轉化 在反應罐內配制磷酸鹽緩沖液3000L，加入KH2P04 2 . 24g/L及Na2HP04 · 12H20 1. 24g/ L，用HC1調節pH約為6· 2 ; 將棘白菌素 B底物溶于乙醇中，濃度15% ; 控制反應罐溫度28~32 °C，攪拌200rpm，初次向反應罐內投加實施例6方法制備的粗酶 120kg，并且緩慢加入80L 15%的棘白菌素 B乙醇溶液使轉化反應液中棘白菌素 B含量為 0.4%，開始轉化； 轉化8h后，向反應罐內投加粗酶120kg，并且緩慢加入20L 15%的棘白菌素 B乙醇溶 液； 轉化16h后，向反應罐內投加粗酶90kg，并且緩慢加入20L 15%的棘白菌素 B乙醇溶 液； 轉化24h后，向反應罐內投加粗酶60kg ; 用HPLC監測棘白菌素 B底物及棘白菌素 B母核濃度，當棘白菌素 B底物濃度不再減少， 棘白菌素 B母核濃度不再增加，結束轉化，發酵液過濾，取濾液HPLC定量檢測棘白菌素 B母 核含量，并計算棘白菌素 B的摩爾轉化率為83%。過濾的沉淀主要為未轉化的棘白菌素 B底 物，可回收并在下次轉化時使用。
【主權項】
1. 將棘白菌素 B轉化成棘白菌素 B母核的方法，包括以下步驟： 1)、發酵能將棘白菌素 B脫酰酶表達在胞外的基因工程菌，獲得棘白菌素 B脫酰酶； 2 )、發酵完成后，將發酵液過濾或離心，得到上清液，向上清液中加入上清液體積的 40%~80%(w/v)重量的非重金屬鹽，攪拌2~8小時，過濾或離心收集沉淀，得到粗酶； 3) 、將棘白菌素 B溶于甲醇、乙醇或二甲亞砜中，得到質量濃度為5~15%的棘白菌素 B 溶液； 4) 、將步驟3)制備的棘白菌素 B溶液和步驟2)制備的粗酶分別分批加入到磷酸鹽緩 沖液中，攪拌，使棘白菌素 B轉化為棘白菌素 B母核，監測轉化體系中棘白菌素 B及棘白菌 素 B母核濃度，當棘白菌素 B濃度不再減少，棘白菌素 B母核濃度不再增加時，結束轉化。2. 如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)所述的非重金屬鹽為硫酸銨。3. 如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4)所述磷酸鹽緩沖液濃度為0. 05~0. 15M。4. 如權利要求3所述方法，其特征在于，步驟4)所述磷酸鹽緩沖溶液用鹽酸調節pH至 5. 5~6. 5 〇5. 如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4)分批添加粗酶次數為3~6次，每次間 隔2~8小時，每次添加量為轉化反應溶液體積的1%~4%(w/v)。6. 如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4)分批添加棘白菌素 B溶液次數為 2~5次，每次間隔2~8小時，每次添加量以棘白菌素 B計算相當于轉化反應溶液體積的 0· 1%~0· 4%(w/v) 〇7. 如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4)加入到磷酸鹽緩沖溶液中的棘白菌素 B的初始量為反應溶液體積的0. l°/〇~0. 4% (w/v);加入到磷酸鹽緩沖溶液中粗酶的初始量 為轉化反應溶液體積的1%~4%(w/v)。8. 如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4)轉化過程中采用HPLC監測轉化體系中 棘白菌素 B及棘白菌素 B母核濃度。
【專利摘要】本發明公開了一種棘白菌素B微生物酶轉化方法，具體涉及棘白菌素B轉化為棘白菌素B母核的方法。包括在微生物發酵生成棘白菌素B脫酰酶后提取粗酶，然后通過分批添加粗酶及棘白菌素B的方式進行轉化。本發明方法的摩爾轉化率高，產物濃度高，利于分離純化，且棘白菌素B底物利于回收再利用，降低了生產成本。
【IPC分類】C12R1/47, C12P21/04
【公開號】CN105648000
【申請號】
【發明人】別一, 郭明, 袁建棟
【申請人】重慶乾泰生物醫藥有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月19日