對橙色粘球菌jch-04次級代謝產物分離純化提取抗霉枯草菌素的方法

對橙色粘球菌jch-04次級代謝產物分離純化提取抗霉枯草菌素的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及橙色粘球菌JCH-04，具體涉及一種對橙色粘球菌JCH-04次級代謝產物 分離純化提取抗霉枯草菌素的方法。
【背景技術】
[0002] 抗菌脂肽具有區別于常規抗生素的全新抗菌機制，不僅不易產生耐藥性，而且對 傳統藥物已具有耐藥性的菌株仍然有良好的殺菌和抑菌功效；同時，其抗菌譜之廣、抗菌效 果佳、不殘留，對G_、G+菌、真菌和支原體等均具有良好的抑制和殺滅作用，隨著達托霉素、 棘白霉素等新一代脂肽類抗生素的上市，越來越多的科研工作者將目光轉移至對該類抗菌 物質的研發上，使其成為綠色安全、新型高效的抗菌藥物的研發方向。
[0003] 抗菌脂肽常見于解淀粉芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌的次級代謝產物中，而粘細菌 作為天然活性物質的生產者，是一類重要的藥源菌，可產生異常豐富的次級代謝產物，包括 芳香族，雜環類，醌類，大環類，聚醚類，多烯類，肽類化合物等，卻未見報道其可產抗菌脂肽 類物質。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于:提供一種對橙色粘球菌JCH-04次級代謝產物分離純化提取抗 霉枯草菌素的方法，對橙色粘球菌JCH-04進行發酵培養，由其次級代謝產物分離純化提取 抗霉枯草菌素 (Mycosubtilin)，它是抗菌脂肽的一種，擴大抗菌脂肽的提取途徑。
[0005] 本發明的技術解決方案是:對橙色粘球菌JCH-04的次級代謝產物進行分離純化提 取抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)，該澄色粘球菌JCH-〇4(Myxococcus fulvus JCH-04)在中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址:北京市朝陰區大屯路中國科學 院微生物研究所，保藏日期2009年1月22日，保藏編號為:CGMCCNo. 2893;取一環菌種接種于 裝有25mL種子培養基的250mL搖瓶中，30°C 180rpm培養2天得種子液;將種子液以體積比1: 10接種于含有l〇〇mL發酵培養基的500mL三角瓶中，30°C 180rpm培養6天，得發酵液；將 1000mL發酵液用60目篩過濾，收集樹脂，裝入層析柱中，用質量濃度20%甲醇沖洗，再用純甲 醇洗脫，收集洗脫液，50°C旋轉蒸發，濃縮得粗提物;粗提物1.9631g中分別加入50mL的水和 乙酸乙酯，混勻后離心，吸取水相，冷凍干燥得凍干粉;凍干粉563.5mg用3mL純甲醇溶解，離 心，取上清液，通過Sephadex LH-20凝膠層析分離，收集140~180min的餾分;將餾分于50°C 旋蒸濃縮至2mL，通過半制備色譜分離，收集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分， 分別為C14 Mycosubtilin和C15 Mycosubtilin。
[0006] 其中，對橙色粘球菌JCH-04的次級代謝產物進行分離純化提取抗霉枯草菌素 (Mycosubtilin)的具體步驟是： (1)種子液培養:取上一環保藏編號為CGMCC No. 2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種接種 于裝有25mL種子培養基的250mL搖瓶中，30°C 180rpm培養2天，得種子液;其中，使用的液體 種子培養基配方g/L計為：土豆淀粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉 2.0~10，CaCl20.5~2.0，MgS〇4 · 7Η20 0.5~2.0，Fe3+-Na-EDTA 0.005~0.02,去離子水定 容至lOOOmL，pH 7.2; (2) 發酵培養:將上述種子液以體積比1:10接種于含有100mL發酵培養基的500mL三角 瓶中，30°C 180rpm培養6天，得發酵液;其中，使用的液體發酵培養基配方g/L計為：土豆淀 粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉2.0~10，CaCl 20.5~2.0，MgS〇4· 7H20 0.5~2.0，Fe3+-Na-EDTA 0.005~0.02,甘油 5.0~15，XAD-16 大孔吸附樹脂 15~ 30,去離子水定容至1000mL，pH 7.2; (3) 提取粗產物:將上述1000mL發酵液用60目篩過濾，收集樹脂，先用水洗去樹脂表面 殘留的發酵液，然后將樹脂裝入玻璃層析柱中，層析柱規格2 X 50cm，用100mL質量濃度20% 甲醇以lmL/min的流速流過樹脂柱清洗樹脂，再用純甲醇以lmL/min的流速洗脫樹脂，收集 甲醇洗脫液200mL，將200mL甲醇洗脫液于50°C旋轉蒸發，濃縮得油脂狀粗提物，稱重為 1.9631g； (4) 萃取:粗提物1.9631 g中分別加入50mL乙酸乙酯和50mL水，溶解粗提物，lOOOOrpm離 心3min，乙酸乙酯相和水相分層，用移液器吸取水相，將水相冷凍干燥得凍干粉，稱重 563.5mg； (5) Sephadex LH-20凝膠層析：用3mL純甲醇溶解凍干粉563.5mg，離心取上清液，通過 Sephadex LH-20凝膠層析分離，凝膠層析柱規格為2X50cm，Sephadex LH-20凝膠量為20g， 洗脫劑為甲醇，流速〇.611117111；[11，收集140~180111；[11的餾分 ； (6) 半制備色譜分離:將上述餾分于50°C旋轉蒸發濃縮至2mL，再采用半制備色譜分離 純化，制備柱為C18柱(Hedera 0DS-2,5ym，10.0X250 mm)，檢測波長215nm，進樣量2mL，收 集保留時間為39.159 min和42.919 min的組分，于50°C旋轉蒸發除去乙腈后，冷凍干燥，分 別得C14 Mycosubtilin 31.4mg和C15 Mycosubtilin 28.6mg0
[0007] 其中，C14 Mycosubtilin分子結構式為：
C15 Mycosubtilin為其同系物，在脂肪酸直碳鏈上多一個亞甲基(-CH2)。
[0008] 本發明的優點是： 1、從橙色粘球菌的次級代謝產物中發現了抗霉枯草菌素的兩個同系類化合物，擴大抗 菌脂肽的提取途徑，并提供了發酵制備、分離純化方法，實現有效分離。
[0009] 2、利用本發明的方法，提高了得率，從1L的發酵液中提取到C14 Mycosubti 1 in 31.4mg和C15 Mycosubtilin 28.6mg，收率遠高于酸沉淀法，經HPLC分析，純度達到了98% 以上。
[0010] 3、本發明涉及到抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)同系物對G一、G+菌、真菌和支原體 等均具有良好的抑制和殺滅作用，不易產生耐藥性，對于開發綠色安全、新型高效的抗菌藥 物具有重大意義。
【附圖說明】
[0011] 圖1為G1紅外光譜圖。
[0012] 圖2為G2紅外光譜圖。
[0013]圖3為茚三酮實驗結果。
[0014]圖4為G1質譜分析結果。
[0015]圖5為G2質譜分析結果。
[0016]圖6為G1氨基酸分析結果。
[0017]圖7為G2氨基酸分析結果。
[0018]圖8為G1二級質譜分析結果。
[0019] 圖9為C14 Mycosubtilin HPLC圖。
[0020] 圖 10為C15 Mycosubtilin HPLC圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例進一步說明本發明的技術解決方案，實施例不能理解為是對 技術方案的限制。
[0022] 實施例:依以下步驟對橙色粘球菌JCH-04的次級代謝產物進行分離純化提取得抗 霉枯草菌素(Mycosubtilin) (1) 種子液培養:取上一環保藏編號為CGMCCNo . 2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種接種 于裝有25mL種子培養基的250mL搖瓶中，30°C 180rpm培養2天，得種子液;其中，使用的液體 種子培養基配方g/L計為：土豆淀粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉 2.0~10，CaCl 20.5~2.0，MgS〇4 · 7H20 0.5~2.0，Fe3+-Na-EDTA 0.005~0.02,去離子水定 容至 1000mL，pH 7.2; (2) 發酵培養:將上述種子液以體積比1:10接種于含有100mL發酵培養基的500mL三角 瓶中，30°C 180rpm培養6天，得發酵液;其中，使用的液體發酵培養基配方g/L計為：土豆淀 粉5.0~15,葡萄糖2~5,酵母粉0.5~10，脫脂奶粉2.0~10，CaCl 20.5~2.0，MgS〇4· 7H20 0.5~2.0，Fe3+-Na-EDTA 0.005~0.02,甘油 5.0~15，XAD-16 大孔吸附樹脂 15~ 30,去離子水定容至1000mL，pH 7.2; (3) 提取粗產物:將上述1000mL發酵液用60目篩過濾，收集樹脂，先用水洗去樹脂表面 殘留的發酵液，然后將樹脂裝入玻璃層析柱中，層析柱規格2 X 50cm，用100mL質量濃度20% 甲醇以lmL/min的流速流過樹脂柱清洗樹脂，再用純甲醇以lmL/min的流速洗脫樹脂，收集 甲醇洗脫液200mL，將200mL甲醇洗脫液于50°C旋轉蒸發，濃縮得油脂狀粗提物，稱重 1.