解步驟(2)得到的脫膠蠶絲，采用MW⑶1000超濾膜對 脫膠蠶絲進行濃縮脫鹽處理。
[0030] (4)將堿性蛋白酶(Alcalase2.4L)和復合風味蛋白酶(Flavorzyme)按照3:2比例 混合，添加2%的復合蛋白酶水解步驟(3)制備的脫膠蠶絲濃縮液，控制反應條pH8.5,溫度55 °C，反應時間5h，采用半微量凱氏定氮法與甲醛法滴定氨基態氮聯合測定蠶絲抗菌肽的得 率。
[0031] 所述步驟(4)脫膠蠶絲縮液濃度為4%。
[0032] 所述步驟(4)蠶絲抗菌肽得率計算方法如下： 脫膠蠶絲中蛋白質含量
式中：T樣品中蛋白質質量(g) V2-樣品消耗硫酸標準溶液體積(mL) Vi-空白消耗硫酸標準溶液體積(mL) C-硫酸標準溶液濃度(mo 1/L) 0.014-與l.OmL硫酸標準溶液相當的氮的質量(g) 6.25氮換算為蛋白質的系數 W-樣品質量(g) V---試樣分解液總體積(mL ) V'-一試樣分解液蒸餾用體積(mL) 氨基態氮含量：
式中:A---樣品中總的游離氨基酸質量(g) VI-空白試驗加入甲醛后滴定至終點所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積(mL) V2-樣品稀釋在加入甲醛后滴定至終點pH9.2所消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積 (mL) C氫氧化鈉標準溶液濃度(mol/L) 0.014氮的毫摩爾質量(g/mmol) V-測定用樣品溶液的體積(mL) 蠶絲抗菌肽的得率
(5)取經過脫膠和復合蛍臼_7火觶處理過樣品，置t截留分子量2000Da的透析袋(G-RC-18-2K)中對純水透析48h，每隔8h換水一次透，透析結束后，再用聚乙二醇6000濃縮至原 體積的1/5,收集備用，即為蠶絲多肽物質濃縮液。
[0033] (6)采用DEAE-52離子交換層析柱初步分離純化步驟(5)制備的蠶絲多肽濃縮液。
[0034] 步驟(6)所述DEAE-52離子交換層析柱規格為20mm*65cm。
[0035] 步驟(6)所述DEAE-52離子交換層析柱平衡采用蒸餾水洗至中性。
[0036] 步驟(6)所述DEAE-52離子交換層析柱上樣，吸取步驟(5)制備的蠶絲多肽濃縮液 5mL到事先用蒸餾水平衡過的柱子內，這時打開柱子出液口止水閥，使樣品滲到層析介質 內，米用蒸饋水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl各 100 mL進行梯度洗 脫，流速控制在0.5 mL/min，用考馬斯亮藍比色法進行跟蹤檢測，最后根據梯度洗脫曲線收 集合并單一洗脫峰。
[0037] (7)將步驟(6)收集的洗脫液置于截留分子量2000Da的透析袋(G-RC-18-2K)中對 純水透析48h，每隔8h換水一次透，透析結束后，真空冷凍干燥，即得蠶絲抗菌肽初分離粉 末。
[0038] (8)利用蒸餾水溶解步驟(7)制備的蠶絲抗菌肽初分離粉末，即得，蠶絲抗菌肽初 分離溶液。
[0039]步驟(8 )所述的蠶絲抗菌肽初分離溶液濃度為1 g/mL。
[0040] (9)利用Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱進一步純化步驟(8)制備的蠶絲抗菌肽初分 離溶液。
[0041 ] 步驟(9)所述Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱規格為16mm*100cm。
[0042] 步驟(9)所述Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱，使用前柱子需要進行平衡處理，采用 pH7.8的磷酸磷酸鹽緩沖液平衡柱子，流速控制在0.5mL/min，當流出液的pH與平衡緩沖液 pH-致時，層析柱達到平衡。
[0043] 步驟(9)所述Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱上樣方法，吸取步驟(8)制備的蠶絲抗 菌肽初分離溶液5mL到事先用磷酸磷酸鹽緩沖液平衡過的柱子內，這時打開柱子出液口止 水閥，使樣品滲到層析介質內。
[0044]步驟(9)所述Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱洗脫與收集方法，當樣品凹液面接近柱 床表面時用滴管緩慢滴加一定高度的蒸餾水，防止在洗脫的時候直接滴加洗脫液破壞柱床 表面，用0.2mol/L的磷酸磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速0.5mL/min，每管收集5mL，用考馬斯 亮藍比色法進行跟蹤檢測，最后根據梯度洗脫曲線收集合并單一洗脫峰。
[0045] (10)合并步驟(9)收集的洗脫峰，在_16°C預凍洗脫液，在空載情況下，按照溫度0 °C、_10°C、_20°C、_30°C進行程序降溫，時間lh，在真空度0.06MPa干燥24h，即得蠶絲多肽粉 末。
【主權項】
1. 一種飼用蠶絲抗菌肽制劑及其制備方法，包括如下步驟： (1) 將廢蠶絲利用濃度為0.2%-0.6%的碳酸鈉溶液進行脫膠處理； (2) 氯化鈣溶解步驟(1)制備的膠脫膠蠶絲，利用蛋白酶進行酶解； (3) 透析、濃縮、沉淀步驟(2)制備的蠶絲多肽溶液； (4) 利用離子交換層析和葡聚糖凝膠層析分離純化步驟(3)制備的蠶絲多肽溶液； (5) 將步驟(4)制備的蠶絲抗菌肽溶液進行冷凍干燥，得到蠶絲抗菌肽產品。2. 根據權利要求1所述的廢蠶絲脫膠工藝，其特征在于碳酸鈉溶液濃度0.2%-0.6%、固 液比為1:30-1:70(g/mL)，脫膠時間30-60min。3. 根據權利要求1所述的蛋白酶酶解工藝，其特征在于復合蛋白酶配比為1:1-1:3,控 制底物濃度3%_5%、加酶量1%-2.5%、pH8-9、反應溫度45 °C -65 °C、酶解時間2.5h-6.5h。4. 根據權利要求1所述的步驟(3)，其特征在于透析袋截留分子量2000Da，采用飽和硫 酸銨沉淀蠶絲多肽。5. 根據權利要求1所述的蠶絲多肽分離純化工藝，其特征在于采用DEAE_52、Sephadex G-25葡聚糖凝膠進行分離純化，DEAE-52離子交換柱層析流動相采用蒸餾水、0.1 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl，流速控制在0.5 mL/min;Sephadex G-25葡聚糖凝 膠柱層析流動相采用pH7.8的磷酸磷酸鹽緩沖液，流速控制在0.5mL/min。6. 根據權利要求1所述的蠶絲抗菌肽干燥工藝，其特征在于蠶絲抗菌肽溶液_16°C預 凍，真空度0. 〇6MPa，干燥24h。
【專利摘要】本發明公布了一種飼用蠶絲抗菌肽制劑及其制備方法，該制備方法包括以下步驟：（1）廢蠶絲脫膠及脫膠蠶絲的氯化鈣溶解；（2）將步驟（1）制備的脫膠蠶絲溶液采用堿性蛋白酶（Alcalase2.4L）和復合風味蛋白酶（Flavorzyme）按照3:2比例混合，控制反應條pH8.5，溫度55℃，反應時間5h，制成蠶絲多肽酶解液；（3）透析、脫鹽、濃縮步驟（2）制備的蠶絲多肽酶解液；（4）DEAE-52、Sephadex？G-25葡聚糖凝膠分離純化蠶絲抗菌肽；（5）真空冷凍干燥步驟（4）制備的蠶絲抗菌肽溶液，即得成品。本發明的目的在于提供一種綠色、替代飼料添加劑抗生素、回收廢棄蠶絲、制備工藝簡單、易清洗蠶絲多肽制備工藝。
【IPC分類】C07K1/36, C07K1/34, C07K1/18, C07K1/30, A23K20/147, C07K1/16, C12P21/06
【公開號】CN105648008
【申請號】
【發明人】趙迎慶, 劉洋, 鄒芳平, 孫標
【申請人】山東潤牧生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月4日