體過程為： ① 超濾:將上述酶解上清液于0.2 MPa的工作壓力和25°C的工作溫度下采用采用3 kDa 超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液； ② 活性碳吸附純化制:將超濾酶解液調pH值至2.8，按照物料與活性炭顆粒比為12:1將 超濾酶解液以0.4 mL/min流速緩慢加入到活性炭顆粒裝載于玻璃柱中，上樣完成后，采用 3柱體積的1:1比例的lmol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，干燥，得活 性肽精制多肽 ③大孔樹脂精制:將活性碳精制多肽配成15 mg/mL的溶液，調pH值至7.0，緩慢加入到 物料與AB-8大孔樹脂比為15:1的玻璃柱中，用2倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用3柱 體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為鯊魚魚肉高F值寡肽。
[0016] 經測定，所得鯊魚魚肉高F值寡肽的蛋白含量為96.0%，氨基酸總量為85.1%，支鏈 氨基酸的含量為17.0%，芳香族氨基酸的含量為0.45%，F值為37.7,分子量為657 Da，支鏈 氨基酸中 Val: 11 e: Leu為 1:1.2:3.3，芳香族氨基酸中Trp: Tyr: Phe為 1:1.1:1 ~1.3。
[0017] 將制得的鯊魚魚肉高F值寡肽做小鼠的抗疲勞活性研究(對小白鼠游泳時間及血 乳酸、肝糖原、血尿素氮等指標的影響），評價其的抗疲勞活性。
[0018] 實驗結果表明：制得的鯊魚魚肉高F值寡肽能夠顯著增加小鼠力竭游泳時間，提高 運動耐力，提高小鼠體內的肝糖原含量，降低血乳酸及血尿素氮產生量。。
[0019]表lg魚魚肉高F值寡肽對小鼠游泳時間的影響(η = 15,平均值土SD)
注:灌胃體積0.25mL/天，空白對照組每天灌胃同體積的生理鹽水。
[0020]表2鯊魚魚肉高F值寡肽對小鼠血乳酸、肝糖原、血尿素氮含量的影響(η = 15,平 均值土 SD)
注：濯冑體枳0.25mL/大，空白對照組每大濯冑問體枳的生理鹽水。
[0021]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明 不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直 接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種鯊魚魚肉高F值寡肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 鯊魚魚肉醇溶蛋白的制備:取鯊魚魚肉按1 g:15 mL~1 g:20 mL固液比加入90%~ 95%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機將其制成勻漿，在25~30°C、功率650~700 W超聲提取 150 min~180 min;將提取液的pH值用1 mol/L NaOH調至9.5~10.0,用蒸餾水將乙醇濃 度調至55%~65%，室溫靜置45 min~60 min，于8000~10000 rpm離心10 min~15 min;取 上清液，并加入NaCl至濃度為5%~8%，靜置8 h~10 h后，于8000~10000 rpm離心10~15 min，收集沉淀，凍干，即得鯊魚魚肉醇溶蛋白； 2) 鯊魚魚肉醇溶蛋白的酶解:取鯊魚魚肉醇溶蛋白，按固液比1 g:5 mL~1 g:10 mL， 加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液，用0.1 mol/L HC1或0.1 mol/L NaOH調節pH到9.0~1.0,得 混合液;將混合物溫度調制55~65°C，按照醇溶蛋白質量的0.5 %~1.0 %加入堿性蛋白酶， 酶解時間3 h~4 h后，酶解液于90~95°C保溫10~15min，滅酶活;將酶解液溫度調至50~ 60 °C，按照醇溶蛋白質量的0.6 %~0.8%加入木瓜蛋白酶，酶解時間4 h~5 h，酶解液降至 室溫，于8000~10000 rpm離心10~15 min，取上清液； 3) 鯊魚魚肉高F值寡肽的酶解:將上述上清液依次經超濾、活性碳吸附純化和大孔樹脂 精制，得鯊魚魚肉高F值寡肽； 其中，所述步驟2)中的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液含0.05mo 1/L，pH值為9.5;堿性蛋白 酶酶活力為1.95 X 105。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的鯊魚優選為灰星鯊 (Mustelus griseus)。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾、活性碳吸附純化和 大孔樹脂精制的具體過程為： 超濾：將上述酶解上清液于0.1~0.15 MPa的工作壓力和20~30°C的工作溫度下采用 采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液； 活性碳吸附純化制:將超濾酶解液調pH值至2.5~3.5，按照物料與活性炭顆粒比為10~ 15:1將超濾酶解液以0.3~0.5mL/min流速緩慢加入到活性炭顆粒裝載于玻璃柱中，上樣 完成后，采用2~3柱體積的1:1比例的lmol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗 脫液，干燥，得活性肽精制多肽 大孔樹脂精制:將活性碳精制多肽配成10~20 mg/mL的溶液，調pH值至6.5~7.5，緩慢 加入到物料與AB-8大孔樹脂比為10~15:1的玻璃柱中，用2~3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去 雜質，再用2~3柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為鯊魚魚肉高F 值寡肽。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所制備的高F值寡肽的蛋白含量為95.1 ~96.4%，氨基酸總量為83.7~85.4%，支鏈氨基酸的含量為16.8~17.1%，芳香族氨基酸的 含量為0.43~0.48%^值為35.2~39.6，分子量為630~720 03，支鏈氨基酸中￥&1:116: Leu為1:1~1 · 5:3~4,芳香族氨基酸中Trp :Tyr :Phe為1:1~1.2:1~1.5〇
【專利摘要】本發明公開了一種鯊魚魚肉高F值寡肽的制備方法。本發明以鯊魚魚肉為原料，通過超聲提取鯊魚魚肉醇溶蛋白、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶酶解，利用的超濾分級、活性炭吸附純化和大孔樹脂精制得鯊魚魚肉高F值寡肽，該F值為35.2～39.6，分子量為630～720？Da；該高F值寡肽具有顯著的抗疲勞效果，可以作為抗疲勞功能食品或保健食品進行開發。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/34, C07K1/36, C07K1/22, C07K1/16
【公開號】CN105648009
【申請號】
【發明人】王斌, 趙玉勤, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月23日