一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種抗氧化活性肽的制備方法，具體涉及一種激活Nrf 2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法。
【背景技術】
[0002]鯊魚全身是寶，有的種類肉質鮮美，是餐桌上常見的菜肴。魚皮具有良好的韌性，是皮革加工業的原料。現代醫學證明鯊魚軟骨也具有很大的藥用價值，1992年美國首先將鯊魚軟骨粉直接用于臨床治療腫瘤。
[0003]雙髻藍(Sphyrna Iewini)為軟骨魚綱，真藍目，雙髻藍科，在我國主要分布于黃海、東海和南海。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種具有激活Nrf2_ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法。
[0005]本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:一種具有激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法，其包括以下步驟:
1)雙髻鯊魚肉的預處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至90?95°C后保溫5?1min，然后按照料液比Ig: 2?4mL加入異丙醇，于25?30°C、功率450?500 W超聲提取2?3 h，然后于4°C、9000~10000 rpm離心10?15min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物；
2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比Ig:1OmL?15mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH調節pH到9.0?10.0，得混合液;將混合物溫度調制55?65°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.2 %?1.5 %加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95X 105 U/g)，酶解時間2 h?2.5h后，酶解液于90?95°C保溫10?15min，滅酶活;將酶解液溫度調至35?45°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.0 %?1.2%加入胰蛋白酶(酶活力22.5\104 U/g)，酶解時間3 h?4 h，酶解液于90?95°C保溫10?15min后降至室溫，于10000?12000 rpm離心10?15 min，取上清液。
[0006]3)雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0007]作為優選，所述步驟3)的超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
超濾:將上述酶解上清液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液。
[0008]大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成15?20mg/mL的溶液，緩慢加入到超濾酶解液與DlOl大孔樹脂比為1:10?15的玻璃柱中，用3?5倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用3?4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽。
[0009]凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20?30mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.8?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的輕基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
[0010]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?45min乙腈濃度由O勻速升至45%);洗脫速度
0.8~1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。
[0011]與現在技術相比，本發明所提供的一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法，其特征在于Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)還可促進Nrf2蛋白質積累，激活Nrf2-ARE通路，進而上調抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷。因此，Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關疾病治療的藥物或功能產品。。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發明的葡聚糖凝膠SephadexG_25層析圖。
[0013]圖2葡聚糖凝膠Sephadex G-25制備酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0014]圖3Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對Nrf2 蛋白質水平的影響。
【具體實施方式】
[0015]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0016]實施例:
雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:雙髻鯊魚肉〃雙酶酶解〃酶解物"超濾〃大孔樹脂純化〃凝膠過濾層析〃高效液相色譜制備〃抗氧化肽。
[0017]I)雙髻鯊魚肉的預處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至95°(:后保溫811^11，然后按照料液比18:3 mL加入異丙醇，于25°C、功率500 W超聲提取3 h，然后于4°C、10000 rpm離心10 min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物；
2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比I g:12 mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調節pH到9.5，得混合液;將混合物溫度調制60 0C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.2%加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95 X 105 1]/^)，酶解時間2.5 h后，酶解液于95°C保溫15min，滅酶活;將酶解液溫度調至40 V，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.0%加入胰蛋白酶(酶活力> 2.5 X 14 U/g)，酶解時間34 h，酶解液于95°C保溫15min后降至室溫，于12000 rpm離心10 min，取上清液。
[0018]3)雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0019]①超濾:將上述酶解上清液采用采用IkDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液。
[0020]②大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成20mg/mL的溶液，緩慢加入到濾酶解液與D1I大孔樹脂重量體積比(mg/mL )為1: 15的玻璃柱中，用3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽。
[0021]③凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為