25mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為1.0 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物Fr.3(圖1);
④RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成95 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6mm, 5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?45min乙腈濃度由O勻速升至45%);洗脫速度0.8mL/min;紫外檢測波長220 nm)，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽(圖
2)0
[0022]⑤結構檢測:收集羥自由基清除活性最高的多肽DCPE-B，經RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ES1-MS測定分子量為610.77 Da。
[0023]自由基清除實驗:將制得的雙髻鯊魚肉抗氧化肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)進行自由基清除實驗。實驗結果表明= Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對DPPH自由基(EC50 1.89 mg/mL)、輕基自由基(ECso 0.28 mg/mL)和超氧陰離子自由基(ECso
0.13 mg/mL)具有良好的清除作用。
[0024]抗氧化肽對激活Nrf2/ARE通路的作用:取對數生長期的人胚腎細胞株HEK293細胞接種于60mm皿24小時后，分別加入ΙΟμΜ的酶解液和11 e_I Ie-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，繼續培養4小時。棄去上清，細胞用RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術有限公司)裂解，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取20yg蛋白經SDS-PAGE分離，然后按常規免疫印跡方法檢測Nrf2的蛋白水平。結果表明Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可促進Nrf2蛋白質積累(圖3)，激活Nrf2-ARE通路，進而上調抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷。因此，Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關疾病治療的藥物或功能
τ?: 口廣PR ο
[0025]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的一個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種具有激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)雙髻鯊魚肉的預處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至90?95°C后保溫5?1min，然后按照料液比Ig: 2?4mL加入異丙醇，于25?30°C、功率450?500 W超聲提取2?3 h，然后于4°C、9000?10000 rpm離心10?15min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物； 2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比Ig:1OmL?15mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調節pH到9.0?10.0，得混合液;將混合物溫度調制55?65°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.2 %?1.5 %加入堿性蛋白酶，酶解時間2 h?2.5 h后，酶解液于90?95°C保溫10?15min，滅酶活;將酶解液溫度調至35?45 °C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質量的1.0 %?1.2%加入胰蛋白酶，酶解時間3 h?4 h，酶解液于90?95°C保溫10?15min后降至室溫，于10000?12000rpm離心10?15 min，取上清液； 3)雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽； 其中，所述步驟2)中的甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液含0.05mol/L，pH值為9.5 ；堿性蛋白酶的酶活力M.95 X 15 U/g;胰蛋白酶的酶活力2 2.5 X 14 U/g。2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 超濾:將上述酶解上清液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液； 大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成15?20 mg/mL的溶液，緩慢加入到超濾酶解液與DlOl大孔樹脂比為1:10?15的玻璃柱中，用3?5倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用3?4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽； 凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20?30 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.8?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內溶液，比較各峰的羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物； 反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述反相高效液相色譜條件為:進樣量15?20 yL;色譜柱規格為250 mmX4.6 mm，填料直徑為5 μπι的Zorbax SB- Cis;流動相為水-乙腈梯度洗脫，O?45min乙腈濃度，由O勻速升至45%;洗脫速度0.8-1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所制備的抗氧化肽為四肽化合物，氨基酸序列為Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
【專利摘要】本發明公開了一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法。本發明以雙髻鯊魚肉為原料，通過雙酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，ESI-MS測定分子量為610.77Da；制備的高活性抗氧化肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時亦可促進Nrf2蛋白質積累，激活Nrf2-ARE通路，可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關疾病治療的藥物和功能產品。
【IPC分類】C07K1/20, C07K1/16, C12P21/06, C07K1/36, C07K1/34
【公開號】CN105648010
【申請號】
【發明人】王斌, 趙玉勤, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月23日