5111；[11后于570111]1處測定吸 光值A，得到的回歸方程為y = 0.03382x+0.11274，R2 = 0.992，甘氨酸的分子量為75.07Da， 所以換算成-NH2基的μπιο?數的A-C關系為:C = 0.3939A-0.0444。測定樣品中-NH2基時，先將 水解蛋白液稀釋100倍，取〇. 40mL稀釋液于試管中并加1.60mL超純水、1. OmL顯色劑，以后操 作同標準曲線。水解度計算公式為：水解度（DH) = (酶解液中總氮量/氨基態氮含量）X 100%〇
[0031]多肽轉化率的測定
[0032] 先制作標準曲線，用5 % TCA溶液配制不同濃度的G1 y-Gl y-Tyr-Ar g四肽標準溶液， 取4.8mL標準溶液，加入3.2mL雙縮脲試劑，混勾后靜置lOmin，2000r/min離心10min，取上清 液于540nm處測定吸光值，得到回歸方程y = 0.3596x+0.0012，R2 = 0.998。測定樣品中的多 肽含量時，先取2.5mL樣品溶液，加入2.5mL 10 %的三氯乙酸溶液，混勻后靜置lOmin， 4000r/min下離心15min，將上清液轉移到50mL容量瓶中，并用5%TCA定容，搖勻，以后操作 同標準曲線。多肽轉化率（％ )=(原料總蛋白含量/多肽含量）X 100%。
[0033] DPPH清除率測定
[0034]取蛋白酶解液濃縮，噴霧干燥得魷魚皮膠原蛋白肽粉末。配制5mg/mL膠原蛋白肽 溶液，測定其DPPH清除率。取2mL DPPH溶液與同體積樣品液混合搖勻在黑暗處反應30min， 于517nm波長處測定其吸光值。抑制率計算公式如下：
[0035] DPPH清除率（％ ) = [ 1 -(Ai-Aj) /Αο ] X 100 %
[0036] 式中：Ai為DPPH與樣品的混合液的吸光度:Aj為乙醇與樣品的混合液的吸光度;Ao 為DPPH與水的混合液的吸光度。
[0037]膠原蛋白肽分子量分布測定
[0038] 通過Waters 600高效液相色譜儀測量膠原蛋白肽分子量分布，色譜柱是TSK gel 2000SWXL 300mmX 7.8nm。吸取2mL樣品于容量瓶中，用流動相乙腈/水/三氟乙酸（45/55/ 〇. 1)定容，微孔過濾膜過濾后進樣，柱溫為30 °C，流速為0.5mL/min，在220nm下檢測。
[0039] 時間與加酶量的影響
[0040] 先用堿性蛋白酶在酶解溫度為47.5°C、pH為10.5的條件下進行酶解，在用1:2(質 量比）的木瓜蛋白酶復合風味蛋白酶(復合蛋白酶)在pH 7.5、溫度50°C的條件下二次酶解， 分別考察時間與加酶量的影響。結果如表1所示：由極差分析結果可以看出，以水解度為指 標的因素影響程度依次為:C、D、A、B，即復合蛋白酶酶解時間>復合蛋白酶加酶量>堿性蛋 白酶酶解時間 >堿性蛋白酶加酶量，其最佳組合為:A2B2C3D3;以酶解液抗氧化活性為指標 的因素影響程度依次為:D、C、B、A，即復合蛋白酶加酶量>復合蛋白酶酶解時間>堿性蛋白 酶加酶量>堿性蛋白酶酶解時間，最佳組合為:AdsCsDs;以多肽轉化率為指標的因素影響 程度依次為:A、B、C、D，即堿性蛋白酶酶解時間>堿性蛋白酶加酶量>復合蛋白酶酶解時間 >復合蛋白酶加酶量，最佳組合為:AXB2C2D2。
[0041] 表1
[0042]
[0043] 注:時間a:第一步酶解時間(堿性蛋白酶酶解時間）；時間b:第二步酶解時間（復合 蛋白酶酶解時間）。
[0044] 從結果可以看出，堿性蛋白酶第一步水解的時間對最終的酶解液多肽轉化率影響 很大，因此第一步水解時間選擇4h;堿性蛋白酶加酶量對酶解液多肽轉化率也是排在第二 位的，因此選擇0.3%;木瓜蛋白酶復合風味蛋白酶的第二步水解時間對水解度的影響是排 在第一位的，所以選擇4.5h;木瓜蛋白酶復合風味蛋白酶的加酶量對酶解液抗氧化活性的 影響是排第一位的，所以加酶量選擇0.4%。經過綜合分析可知，本試驗的較優條件為 八 182(：303，即先用0.3%堿性蛋白酶在?!110.5、溫度47.5°(：條件下水解411，再用總量為0.4% 的木瓜蛋白酶復合風味蛋白酶按1:2(質量比）在pH 7.5、溫度50°C的條件下繼續水解4.5h。 通過對工藝進行驗證試驗可知魷魚皮在該條件下酶解，其水解度可達28.89 %、DPPH清除率 為88.24%，多肽轉化率為49.74%。
[0045] 在上述優化后工藝條件下制備獲得的膠原蛋白肽分子量分布情況如表2所示：
[0046] 表 2
[0047]
[0048] 由表2可以發現經過堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶的兩步水解后制備獲 得的膠原蛋白肽分子量較低，97.63%膠原蛋白肽分子量小于2000Da，84.56%膠原蛋白肽 分子量分布介于180Da~2000Da之間，其中，87.25%膠原蛋白肽分子量小于10000 &。表明堿 性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶3種酶復合酶解有利于小分子肽的形成。十個氨基酸組 成的小肽是比較好的產品，分子量小于1500Da，而分子量越小，越容易被有效吸收。所以，通 過此工藝提取的膠原蛋白肽品質較好，符合市場需求。另外，產品中分子量小于180Da的部 分比例較高，這可能與風味蛋白酶的酶解機制有關。風味蛋白酶為一種端肽酶，易將蛋白水 解成氨基酸，但它對產品風味的改善有很大的幫助。
【主權項】
1. 一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于:原料魷魚皮預處理后，先 經堿性蛋白酶水解后，再經復合蛋白酶繼續水解得到膠原蛋白水解液，其中，復合蛋白酶由 木瓜蛋白酶與風味蛋白酶組成。2. 根據權利要求1所述的酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于:原料預 處理的步驟為:將魷魚皮解凍清洗干凈，用0.5 %NaOH溶液浸泡12h，清水洗凈之后，切碎，真 空包裝后貯藏于_20°C冰箱。3. 根據權利要求1所述的酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于:堿性蛋 白酶的加酶量為0.2~0.4%，堿性蛋白酶水解pH為9.5~10.5，堿性蛋白酶水解溫度為47.5 ~52.5 °C，堿性蛋白酶水解時間為3~5h。4. 根據權利要求1所述的酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于:復合蛋 白酶中，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質量比為1:0.5~3。5. 根據權利要求1所述的酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于:復合蛋 白酶的加酶量為0.2~0.4%，復合蛋白酶水解pH為7~8，復合蛋白酶水解溫度為50~55°C， 復合蛋白酶水解時間為2~5h。6. 根據權利要求1所述的酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于：先用 0.3%堿性蛋白酶在pH 10.5、溫度47.5°C條件下水解4h，再用0.4%復合蛋白酶在pH 7.5、 溫度50°C的條件下繼續水解4.5h，復合蛋白酶中，木瓜蛋白酶與風味蛋白酶的質量比為1: 2〇7. 根據權利要求1所述的酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，其特征在于:水解后 得到的膠原蛋白水解液經活性炭過濾后，經過超濾、二級納濾膜過濾后，再經過反滲透納 濾，最后經過噴霧干燥得到分級的膠原蛋白肽粉。
【專利摘要】本發明涉及一種酶法制備魷魚皮膠原蛋白肽的工藝方法，原料魷魚皮預處理后，先經堿性蛋白酶水解后，再經復合蛋白酶繼續水解得到膠原蛋白水解液，其中，復合蛋白酶由木瓜蛋白酶與風味蛋白酶組成。本發明工藝條件下制備得到的膠原蛋白肽產品，不僅水解度、DPPH清除率、多肽轉化率等均較為理想，而且97.63％膠原蛋白肽分子量小于2000Da，具有較好的品質和較高的利用價值；本發明對魷魚皮膠原蛋白肽后期進一步的分離純化及應用具有較高的理論指導意義。
【IPC分類】C12P21/06
【公開號】CN105648013
【申請號】
【發明人】劉振鋒, 呂衛金, 黃小鳴, 戴圣佳, 劉東紅, 陳士國, 葉興乾
【申請人】浙江宇翔生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月14日