黃蒽醌類。中草藥有效成分的含量可以按照現有文獻所提供的方法進行測定。黃芪多糖含量的測定方法參照:山東產黃芪中黃芪多糖和黃芪甲苷的含量測定，山東中醫藥大學學報，2008年5月第32卷第3期;綠原酸含量的測定方法參照:高效液相色譜法測定杜仲中綠原酸的含量，Chinese Journal of Informat1n on TCM, 2006，13(I);小檗喊含量的測定方法參照:萸連巴布膏中鹽酸巴馬汀和小檗堿的藥動學研究，中國實驗方劑學雜志，2011年3月第17卷第5期;大黃蒽醌提取物含量的測定方法參照:保肝靈顆粒劑中4種大黃蒽醌類成分的大鼠藥動學研究。中成藥。2013年6月，第35卷，第6期。
[0027](5)中草藥配伍的篩選
實驗設置為3個組，每組設3個重復。分別為:對照組添加超純水，試驗I組每毫升培養基中添加黃芪多糖8mg、綠原酸3mg、大黃蒽醌提取物7mg，試驗2組每毫升培養基中添加黃芪多糖I Img、綠原酸5mg、小檗堿15mg。各試驗組于C02培養箱中25 °C密閉培養。培養過程中在第6h、12h、24h進行取樣，為后續的指標測定作準備。
[0028](6)指標測定
血細胞存活率的測定方法按照現有文獻的方法操作，參照:H P C viabilitymeasurement: trypan blue versus acridine orange and propidium 1dide.Transfus1n 40 (6)，693-696。吞噬活性的測定方法按照現有文獻的方法操作，可以參照:Immune responses and express1n of immune-related genes in swimming crabPortunus trituberculatus exposed to elevated ambient ammonia—N stress.Comparative B1chemistry and Phys1logy Part八。抗菌活力、溶菌活力的測定方法按照現有文獻的方法操作，可以參照:Insect immunity.Purificat1n and properties ofthree inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae ofHyalophora cecropia.European Journal of B1chemistry。
[0029]結果分析:
(I)血細胞存活率
由圖1可見:血細胞培養基加入復方中草藥有效成分孵育24h后，各試驗組血細胞存活率與對照組無顯著差異，且存活率都大于85%以上。孵育24h內，各試驗組血細胞存活率無明顯變化。
[0030](2)血細胞吞噬活性
由圖2可見:血細胞培養基加入復方中草藥有效成分孵育24h后，試驗組血細胞吞噬活性均顯著高于對照組(P〈0.05)，而每次測定對照組無顯著差異。兩試驗組中血細胞吞噬活性逐漸增高，于24h達到最高值，且試驗2組中血細胞吞噬活性顯著高于試驗I組(P〈0.05)。
[0031](3)抗菌活性
由圖3可見:血細胞培養基加入復方中草藥有效成分孵育24h后，試驗組抗菌活性均顯著高于對照組(P〈0.05)，而每次測定對照組無顯著差異。各試驗組中抗菌活性于12h達到最高值，并保持穩定至24h ο試驗2組中抗菌活性顯著高于試驗I組(P〈0.05 )。
[0032](4)溶菌活性
由圖4可見:血細胞培養基加入復方中草藥有效成分孵育24h后，試驗組溶菌活性均顯著高于對照組(P〈0.05)，而每次測定對照組無顯著差異。各試驗組中溶菌活性于12h達到最高值，且試驗2組中溶菌活性顯著高于試驗I組(P〈0.05)。
[0033]由實驗結果可知，試驗2組的免疫增強作用高于試驗I組，即在24h內，就可以通過免疫相關指標測定，對中草藥提取物組合是否能夠增強免疫效力有非常明確和直觀的判斷。說明本方法建立的復方中草藥免疫增強劑篩選方法，在24h內能準確篩選出具有較強免疫增強作用的中草藥組合，是一種快速、高效、穩定的篩選技術。
【主權項】
1.一種對蝦用復方中草藥免疫增強劑的快速篩選方法，其特征在于，該方法包括首先制備對蝦肌肉提取液和血細胞培養基，然后分離對蝦血細胞并進行原代培養，同時提取中草藥活性成分，再將中草藥活性成分添加到對蝦血細胞培養基中進一步培養，最后測定免疫相關指標。2.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述對蝦肌肉提取液的制備方法為:幼蝦經暫養后，取腹部肌肉加入平衡鹽進行勻漿，勻漿后再加入平衡鹽溶液進行離心，取上清再次離心，上清液經微孔濾膜過濾后即為制備好的對蝦肌肉提取液。3.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述對蝦血細胞培養基組成為:基礎培養基為2 X Leibovitz’s L_15，其中添加質量分數為20%的胎牛血清和20%的所述對蝦肌肉提取液，以及青霉素鈉、硫酸鏈霉素鈉和兩性霉素B。4.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述分離對蝦血細胞并進行原代培養的具體操作為:首先以海水洗凈對蝦體表，之后用含有青霉素和鏈霉素雙抗的經過高溫消毒的無菌海水暫養l-2d;對對蝦體表進行消毒，然后利用吸入抗凝劑的無菌注射器按照抗凝劑:血淋巴體積比為1:1的比例于對蝦頭胸甲后緣處心臟取血，得到取抗凝血樣品后進行離心，棄上清得到對蝦血細胞，用上述制得的培養基調節血細胞密度并進行接種。5.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述中草藥選取為黃芪、杜仲、黃連和大黃。6.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述中草藥活性成分提取操作為:將中草藥均勻粉碎后，與無水乙醇按照質量體積比為1: 10的比例混勻，70°C回流萃取1.5h，重復萃取兩次，合并濾液，旋轉蒸發除去乙醇即得中草藥活性成分。7.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述的免疫相關指標為血細胞存活率、血細胞吞噬活性、抗菌活性及溶菌活性。8.如權利要求1所述的快速篩選方法，其特征在于，所述中草藥活性成分添加到對蝦血細胞培養基中的添加量為每毫升培養基中添加黃芪多糖5-30mg、綠原酸3-30mg、小檗堿5-.30mg、大黃蒽醌提取物5-30mg。9.如權利要求2所述的快速篩選方法，其特征在于，所述平衡鹽組成為:NaCl18.0 g.L-1,KCl 0.7 g.L-1,NaHCO30.5 g.L-1,KH2PO40.54 g.L-1.10.如權利要求4所述的快速篩選方法，其特征在于，所述的抗凝劑組成為:NaCl.26.325g.L-1,KCl 0.745g.L—\EDTA_2Na 3.7224g.L-1,HEPES 2.383.L-1.
【專利摘要】本發明涉及一種對蝦用復方中草藥免疫增強劑的快速篩選方法，包括：1）對蝦肌肉提取液的制備；2）血細胞培養基的配制；3）對蝦血細胞原代培養；4）中草藥有效成分的萃取；5）存活率、吞噬活性、抗菌及溶菌活性的測定。本發明在對蝦血細胞原代培養體系中添加多種中草藥提取物的組合，能夠快速篩選出增強免疫效果較好的組合。本方法具有快速，高效，準確，穩定等優點，并且采用細胞培養，相較于傳統的養殖模式，檢測成本更低。
【IPC分類】C12Q1/02
【公開號】CN105648024
【申請號】
【發明人】潘魯青, 高國瑞, 黃輝
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月29日