一種暗褐網柄牛肝菌菌種衰退的判定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業技術領域，具體涉及一種暗褐網柄牛肝菌菌種衰退的判定方法。
【背景技術】
[0002] 暗褐網柄牛肝菌(Phlebopus portentosus)屬于牛肝菌目（Boletales)小牛肝菌 科(13〇1〇1：；[116130636)網柄牛肝菌屬(？111613(^118)，是云南省西雙版納地區每年雨季市場上 常見的食用菌，暗褐網柄牛肝菌也是目前唯一能實現菇房周年栽培的牛肝菌。目前對于暗 褐網柄牛肝菌的栽培主要通過野生菌株或者菇房栽培菌株組織分離獲得母種，母種進一步 擴繁后進行栽培測產來選育優良菌株。目前栽培模式下，優良菌株在繼代一定次數后就會 發生衰退，只能通過不斷地分離、篩選優良菌株來保證生產的延續性。為了防止勿用衰退菌 株造成不可挽回的經濟損失，在進入生產之前有效辨別菌株活力顯得極其重要。
【發明內容】
[0003] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種暗褐網柄牛肝菌菌種衰退的判定方法，通 過本發明所述方法能夠及時對暗褐網柄牛肝菌菌種活性作出預判，進而有效防止栽培衰退 菌株造成的經濟損失。
[0004] 本發明采取的技術方案如下：
[0005] 1、暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，包括如下步驟：
[0006] (1)觀察菌落形態、測定生長速率:菌株30°C避光培養，分別于至少5個不同時間點 十字交叉法測量菌落半徑，計算平均菌落生長速率；同時于菌絲體長滿培養皿時觀察菌落 形態特征;與菌株第一代原種相比，菌落吐水少，菌核小，平均菌落生長速率變化率2 10% ;
[0007] 所述平均菌落生長速率變化率=(I菌株平均菌落生長速率一第一代原種平均菌 落生長速率|)/第一代原種平均菌落生長速率X100% ;
[0008] 所述平均菌落生長速率為：以不同時間點為橫坐標，不同時間點對應的平均菌落 半徑為縱坐標，獲取的直線斜率即為菌株平均菌落生長速率；
[0009] (2)測定菌落淀粉酶分泌能力：菌株培養15天后用剛果紅法或盧戈氏碘液法獲得 淀粉變色圈，然后采用十字交叉法測定平均菌落直徑和平均變色圈直徑，并與菌株第一代 原種對應結果數據進行比較，采用剛果紅法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 10%，采用盧戈氏碘液法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 5% ;
[0010] (3)可溶性蛋白分析:菌株150rpm、30°C避光振蕩培養7天，過濾，濾渣清洗，除水， 液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液混勾，12000rpm離心10min，吸取上清 液即為可溶性蛋白樣品，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行可溶性蛋白分析，與菌株第一 代原種相比，相對分子量為40 .OkDa的可溶性蛋白條帶變弱，而相對分子量為22. OkDa的可 溶性蛋白條帶增強；
[0011] (4)酯酶同工酶分析:菌株150rpm、30 °C避光振蕩培養7天，過濾，濾渣清洗，除水， 液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH為5.6的磷酸鹽緩沖液混勾，12000rpm離心10min，吸取上清 液即為酯酶同工酶樣品，使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行酯酶同工酶分析，與菌株第 一代原種相比，相對分子量為37. OkDa的酯酶同工酶活性增強。
[0012] 優選的，步驟（1)所用培養基為Ml固體培養基，（3)和(4)中所用培養基為Ml液體培 養基。
[0013] 優選的，按重量份計，所述Ml液體培養基的成分組成為：
[0014] 去皮馬鈴薯200.0份，葡萄糖20.0份，酵母膏2.0份，MgS〇4 · 7H20 1.0份，KH2P〇4l.O 份，水1000.0份;Ml固體培養基在液體培養基的基礎上加15.0份瓊脂粉。
[0015] 優選的，步驟(2)中盧戈氏碘液法測定淀粉變色圈直徑使用的菌種培養基為Ml淀 粉固體培養基，按重量份計，所述Ml淀粉固體培養基的成分組成為：
[0016] 去皮馬鈴薯200.0份，葡萄糖10.0份，酵母膏2.0份，MgS〇4 · 7H20 1.0份，KH2P〇4l.O 份，水1000.0份，可溶性淀粉2.0份，瓊脂粉15.0份；
[0017] 剛果紅法測定淀粉變色圈直徑使用的菌種培養基在Ml淀粉固體培養基基礎上加2 份剛果紅。
[0018] 優選的，菌株在培養前先進行菌種活化，所述菌種活化條件為將菌株在Ml固體培 養基上活化，30°C避光培養20天。
[0019] 優選的，步驟(3)中變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠中丙烯酰胺質量體積濃度 為5%，分離膠中丙烯酰胺質量體積濃度為10%，SDS質量體積濃度為0.1 %，電泳電壓為濃 縮膠80V、分離膠150V。
[0020] 優選的，步驟(3)中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠中丙烯酰胺質量體積濃 度為5%，分離膠中丙烯酰胺質量體積濃度為8%，濃縮膠80V，分離膠150V。
[0021 ]優選的，所述步驟（1)中測量菌落半徑的時間點分別在菌株培養的第3、6、9、12、15 和18天。
[0022] 本發明的有益效果在于:本發明通過分析不同繼代次數下暗褐網柄牛肝菌菌落生 長速率，菌落形態特征，淀粉酶活性，可溶性蛋白圖譜，酯酶同工酶圖譜以及出菇測產各個 角度變化規律，找到可以表征暗褐網柄牛肝菌菌種隨繼代次數增多發生衰退的生理生化特 征，為菌種活力鑒定提供了有效的判定方法，該方法為暗褐網柄牛肝菌的菌種衰退提供了 有效的判定依據，大大降低了誤用衰退菌株的風險，有利于暗褐網柄牛肝菌栽培技術的推 廣。
【附圖說明】
[0023] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0024] 圖1菌株菌落形態圖。
[0025 ]圖2可溶性蛋白電泳圖譜，Μ:預染蛋白Mar k e r，相對分子量大小從上到下分別是 150，100,70,50,35,25,20kDa。
[0026]圖3酯酶同工酶電泳圖譜，Μ:預染蛋白Mar ker，相對分子量大小從上到下分別是 100，70，50，35，25kDa;其中，11023、13013上樣蛋白含量為A，B，C的一半。
[0027]以上附圖為原始圖片大小。
【具體實施方式】
[0028] 下面對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體條件的實驗方 法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0029] 一、材料與設備 [0030] 1 · 1供試菌株
[0031] 暗褐網柄牛肝菌11023菌株；13013菌株；11023菌株栽培子實體組織分離菌株 11023-1372次繼代菌株（以下簡稱A)，5次繼代菌株（以下簡稱B)，8次繼代菌株（以下簡稱 〇〇
[0032] 1.2試劑、儀器設備與培養基 [0033] 1.2.1試劑
[0034]葡萄糖，酵母膏，剛果紅，碘，碘化鉀，乙酸-1-萘酯，乙酸-2-萘酯，固藍RR鹽， KH2P〇4，MgS〇4 · 7H20均為分析純，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；瓊脂粉為日本 進口分裝。
[0035] 1.2.2儀器設備
[0036] BIC-250型人工氣候箱，上海博訊公司;DYCE-25E型P4垂直電泳儀，北京六一公司； SK-100B恒溫搖床，上海蘇坤公司。
[0037] 1.2.2培養基
[0038] Ml培養基：去皮馬鈴薯200.0g(煮汁），葡萄糖20.0g，酵母膏2.0g，MgS〇4 · 7H20 1.0g，KH2P〇4l.Og，水1000.01111黑固體培養基另加15.(^瓊脂粉(暗褐網柄牛肝菌母種培養 基的篩選，西南農業學報，2009，P 2Q9-m;暗褐網柄牛肝菌菌絲體培養基的碳源、氮源及無機 鹽的篩選研究，云南農業大學學報，2009，P145-149 ;