f) + 13 · 980，R2 = 0 · 998; 1 gM=-1 · 044Rf+2 · 307，R2 = 0 · 999 J 為相對分子量，單位 kDa。
[0063]酯酶同工酶電泳結果如圖3所示，結果表明，所測試菌種共出現4條的酯酶同工酶 條帶，其中1^ = 0.01，0.40和0.55三個條帶(對應相對分子量為：332.0,77.0,55.01^^)在所 有菌株中出現，而Rf = 0.80(相對分子量為37. OkDa)這條同工酶調帶只在A，B，C中出現，并 且同工酶條帶隨繼代次數增加顏色變深，酶活性增強。
[0064]六、栽培出菇
[0065]按照菌落生長實驗中所述方法活化菌株，每個菌株打取直徑為lcm的菌餅四個，接 種于300ml液體培養基進行種子培養基發酵，培養7天后按照常規方法(Kai-Ping Ji，Yang Cao,Chun-Xia Zhang et al. Cultivation of Phlebopus Portentosus in Southern China[J].Mycological Progress，2011,10(3) :293-300)接栽培種進行出菇培養。接種工 作由同一個操作嫻熟工人完成，每個菌株培養90袋。統計污染情況，統計出菇率，單菇重。 [0066]表3栽培出菇結果
[0067]
[0068] 不同小寫字母表示處理間的差異達到顯著水平(p<0.05);-表示未測試。
[0069] 栽培出菇結果如表3所示，隨著繼代次數增加，平均單菇重減少，標準差增大。隨著 繼代次數增加，抗雜能力逐漸減弱，污染率增加。與優良菌株11023,13013相比，A，B，C單菇 重標準差偏大，出菇不整齊，菇型不一致，抗雜能力弱。
[0070] 綜合上述研究發現，隨著繼代次數的增加，暗褐網柄牛肝菌菌絲體在菌落形態特 征，菌落生長速率，胞外酶，可溶性蛋白，酯酶同工酶以及出菇性狀上均出現不同程度的變 化。淀粉酶是暗褐網柄牛肝菌人工栽培條件下基質利用相關的最主要的胞外酶，因此監測 淀粉酶活性能較好地表征菌種活力。可溶性蛋白以及酯酶同工酶圖譜的變化是基因表達水 平的差異的一種直觀體現。暗褐網柄牛肝菌隨著繼代次數增加，某些蛋白條帶或者酯酶同 工酶條帶有表達升高的趨勢，而有些表達量則降低。蛋白質是基因表達的產物，其種類和表 達量隨著培養時間、培養基種類、培養條件、取樣部位的改變有所差異，因此在進行測試中， 條件需要保持一致。隨著菌種繼代次數的增加發生菌株退化，最終的后果就是產量銳減，出 菇個體之間變異增大，出菇不整齊，直接造成經濟損失。因此在菌種管理過程中，定期監測 上述生理生化特性可以作為一項菌株退化評估的有效手段。
[0071] 最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通 過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在 形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1. 暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 觀察菌落形態、測定生長速率:菌株30°C避光培養，分別于至少5個不同時間點十字 交叉法測量菌落半徑，計算平均菌落生長速率；同時于菌絲體長滿培養皿時觀察菌落形態 特征;與菌株第一代原種相比，菌落吐水少，菌核小，平均菌落生長速率變化率2 10% ; 所述平均菌落生長速率變化率=(I菌株平均菌落生長速率一第一代原種平均菌落生 長速率|)/第一代原種平均菌落生長速率X100% ; 所述平均菌落生長速率為：以不同時間點為橫坐標，不同時間點對應的平均菌落半徑 為縱坐標，獲取的直線斜率即為菌株平均菌落生長速率； (2) 測定菌落淀粉酶分泌能力：菌株培養15天后用剛果紅法或盧戈氏碘液法獲得淀粉 變色圈，然后采用十字交叉法測定平均菌落直徑和平均變色圈直徑，并與菌株第一代原種 對應結果數據進行比較，采用剛果紅法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 10%， 采用盧戈氏碘液法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 5% ; (3) 可溶性蛋白分析:菌株150rpm、3(TC避光振蕩培養7天，過濾，濾渣清洗，除水，液氮 研磨至粉碎，取粉碎物用pH為7.2的磷酸鹽緩沖液混勻，12000rpm離心10min，吸取上清液即 為可溶性蛋白樣品，采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行可溶性蛋白分析，與菌株第一代原 種相比，相對分子量為40.0 kDa的可溶性蛋白條帶變弱，而相對分子量為22. OkDa的可溶性 蛋白條帶增強； (4) 酯酶同工酶分析:菌株150rpm、3(TC避光振蕩培養7天，過濾，濾渣清洗，除水，液氮 研磨至粉碎，取粉碎物用pH為5.6的磷酸鹽緩沖液混勾，12000rpm離心10min，吸取上清液即 為酯酶同工酶樣品，使用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行酯酶同工酶分析，與菌株第一代 原種相比，相對分子量為37. OkDa的酯酶同工酶活性增強。2. 根據權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，步驟 (1) 所用培養基為Ml固體培養基，（3)和(4)中所用培養基為Ml液體培養基。3. 根據權利要求2所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，按重 量份計，所述Ml液體培養基的成分組成為： 去皮馬鈴薯200.0份，葡萄糖20.0份，酵母膏2.0份，MgS〇4 · 7H20 1.0份，KH2P0U . 0份，水 1000.0份;Ml固體培養基另加15.0份瓊脂粉。4. 根據權利要求2所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，步驟 (2) 中盧戈氏碘液法測定淀粉變色圈直徑使用的菌種培養基為Ml淀粉固體培養基，按重量 份計，所述Ml淀粉固體培養基的成分組成為： 去皮馬鈴薯200.0份，葡萄糖10.0份，酵母膏2.0份，MgS〇4 · 7H20 1.0份，KH2P0U . 0份，水 1000.0份，可溶性淀粉2.0份，瓊脂粉15.0份； 剛果紅法測定淀粉變色圈直徑使用的菌種培養基為Ml淀粉固體培養基另加2份剛果 紅。5. 根據權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，菌株 在培養前先進行菌種活化，所述菌種活化條件為將菌株在Ml固體培養基上活化，30°C避光 培養20天。6. 根據權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，步驟 (3) 中變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠中丙烯酰胺質量體積濃度為5%，分離膠中丙烯酰 胺質量體積濃度為10%，SDS質量體積濃度為0.1%，電泳電壓為濃縮膠80V、分離膠150V。7. 根據權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，步驟 (3)中非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠中丙烯酰胺質量體積濃度為5%，分離膠中丙烯 酰胺質量體積濃度為8 %，濃縮膠80V，分離膠150V。8. 根據權利要求1所述的暗褐網柄牛肝菌菌種活性衰退的判定方法，其特征在于，所述 步驟(1)中測量菌落半徑的時間點分別在菌株培養的第3、6、9、12、15和18天。
【專利摘要】本發明公開了一種暗褐網柄牛肝菌菌種衰退的判定方法，通過觀察菌落形態、測定生長速率、測定菌落淀粉酶分泌能力、可溶性蛋白分析、酯酶同工酶分析等步驟，對暗褐網柄牛肝菌菌種活性作出預判，找到可以表征暗褐網柄牛肝菌菌種隨繼代次數增多發生衰退的生理生化特征，為菌種活力鑒定提供了快速有效的判定方法，該方法為暗褐網柄牛肝菌的菌種衰退提供了有效的判定依據，大大降低了誤用衰退菌株的風險，有利于暗褐網柄牛肝菌栽培技術的推廣。
【IPC分類】C12Q1/04
【公開號】CN105648030
【申請號】
【發明人】高鋒, 張春霞, 何明霞, 曹旸, 劉靜, 方藝偉, 許欣景, 王文兵, 王云
【申請人】云南省熱帶作物科學研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月26日