暗褐網柄牛肝菌菌種的培養方法， CN101491195A)。
[0039] Ml淀粉固體培養基：去皮馬鈴薯200.0g(煮汁），葡萄糖10.0g，酵母膏2.0g， MgS〇4 · 7H201 · 0g，KH2P〇4l · 0g，水 1000ml，瓊脂粉 15g，可溶性淀粉2g。
[0040] Ml淀粉剛果紅固體培養基:去皮馬鈴薯200.Og(煮汁），葡萄糖10.0g，酵母膏2.0g， MgS〇4 · 7H20 1 · 0g，KH2P〇4l · 0g，水 1000 · 0ml，瓊脂粉15 · 0g，可溶性淀粉2 · 0g，剛果紅2 · 0g。 [0041 ] 二、菌落生長實驗
[0042]將測試菌株在Ml固體培養基上活化，30°C避光培養20天，用直徑為lcm的無菌打孔 器在生長旺盛的菌絲前緣打孔取菌餅，接種于Ml培養基中央，30 °C避光培養。每個培養皿中 央只接種一個菌餅，每種處理至少做5個平行處理。分別于培養后第3、6、9、12、15和18天利 用十字交叉法測量菌落直徑，觀察菌落形態特征（吐水情況，菌核情況）。利用Microsoft EXCEL中的SLOPE函數求出菌落生長速率(v): v = 1/2*SL0PE ({菌落平均直徑集合}，{測量時 間集合})，其中菌落半徑單位為mm，測量時間單位為d，則生長速率單位為mm/d。例如，第11 天測量菌落直徑為dl，第t2天測量菌落直徑為d2，第t3天測量菌落直徑為d3，第t4天測量菌 落直徑為d4,......，則v=l/2*SL0PE( {dl，d2，d3，d4,......}，{tl，t2，t3，t4，......})。具體以 某次測量結果為例：tl = 3，t2 = 6，t3 = 9，t4 = 12，t5 = 15;dl = 10.41，d2 = 16.62，d3 = 23.93,(14 = 32.21，d5 = 41.39;貝lJv=l/2*SL0PE({ 10.41,16.62,23.93,32.21,41.39}，{3， 6，9,12,15}) = 1/2*2.59 = 1.29(mm/d)。5次及以上平行實驗的菌落生長速率的算數平均值 ±標準差表示平均生長速率，例如某菌株某次試驗中，5個平行實驗菌落生長速率分別為： 2.31，2.94,2.81，2.90,3.15 (mm/d)，則該菌株該次實驗平均生長速率=2 · 82 ± 0 · 28 (mm/ d) 〇
[0043] 菌落形態相關結果見表1和圖1。
[0044] 表1菌落生長實驗結果
[0045]
[0046] 不同小寫字母表示處理間的差異達到極顯著水平(ρ<0.01)，吐水及菌核情況為 菌絲接近長滿平板時觀察結果。
[0047] 由表1和圖1可知，菌種隨著繼代次數的增多，其菌落的吐水和菌核形成能力均減 弱。栽培優良菌株11023、13013平均菌落生長速率與其他3個菌株有極顯著性差異。菌株Α、Β 菌落生長速率極顯著差異于菌株C。隨著繼代次數增多，菌落生長速率變化率2 10%。如與 菌株第一代原種相比，傳代5次后的菌株Β，生長速率變化率為（1.83-1.60)/1.83 = 12%。 [0048] 三、淀粉變色圈實驗
[0049] 剛果紅法:按上述接種方法將菌餅接種于Ml淀粉剛果紅固體培養基中，30°C避光 培養。第15天用十字交叉法測量菌落直徑和變色圈直徑。數據五個及以上平行試驗的平均 值土標準差表示。
[0050] 盧戈氏碘液法：按上述接種方法將菌餅接種于Ml淀粉固體培養基中，30 °C避光培 養。第15天用十字交叉法測量菌落直徑，然后用盧戈氏碘液染色(5.0g碘和10.0g碘化鉀溶 于85.0ml蒸餾水中，碘的總濃度為150mg/ml)用噴壺噴灑于培養基表面，測量未被染成藍色 區域的直徑。數據以五個及以上平行試驗的平均值土標準差表示。
[0051 ]相關實驗結果見表2。
[0052]表2淀粉變色圈實驗結果
[0053]
[0054] 不同小寫字母表示處理間的差異達到顯著水平(p<0.05)。
[0055] 淀粉變色圈實驗結果如表2所示，結果表明暗褐網柄牛肝菌分泌了淀粉酶，且隨著 繼代次數增加，變色圈直徑與菌落直徑之比下降，即相同面積的菌落分泌淀粉酶能力降低， 淀粉酶分泌能力發生了退化。與第一代原種相比，剛果紅法測定變色圈直徑/菌落直徑的比 值降低幅度2 10%，盧戈氏碘液法測定變色圈直徑/菌落直徑的比值降低幅度2 5%。
[0056] 四、可溶性蛋白分析
[0057] 用直徑為lcm無菌打孔器在生長旺盛的菌絲前緣打孔取菌餅四個，接種于裝有 200ml Ml液體培養基的500ml三角瓶中，150rpm，30°C避光振蕩培養7d，無菌紗布過濾，蒸餾 水清洗3遍，用紗布擠去水分，液氮研磨至粉碎，立即稱取1 OOmg研磨物至pH為7.2的磷酸鹽 緩沖液中振蕩混勻，12000rpm離心1 Omin，小心吸取上清液即為蛋白樣品。用改良型 Bradford法蛋白濃度測定試劑盒對蛋白樣品進行定量，通過濃縮或者稀釋使得不同樣品 (測試菌種以及該菌種對應的第一代原種)蛋白濃度保持一致。
[0058]使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)進行可溶性蛋白分析:濃縮膠濃度為 5%，分離膠濃度為10%，SDS濃度為0.1%，測試樣品以及該菌株對應第一代原種的蛋白樣 品以相同體積相同蛋白質濃度在同一塊膠上樣，上樣量為20μ1，電泳電壓為濃縮膠80V、分 離膠150V;溴酚藍迀移至離下端邊緣lcm左右停止電泳。按常規方法進行考馬斯亮藍染色。 根據所得電泳圖譜，計算有差異蛋白條帶的相對迀移率，計算公式為相對迀移率(Rf)=目 標蛋白條帶迀移距離/溴酚藍迀移距。根據蛋白Marker的相對分子量以及各個條帶的相對 迀移率，Excel數據擬合獲得相對迀移率和蛋白質相對分子質量標準曲線。獲得標準曲線 為：]? = -44.540111(1^) + 14.124，1?2 = 0.998;18]\1 = -0.8711^+2.093，1?2 = 0.993。]\1相對分子 量，單位kDa。
[0059] 實驗結果見圖2。結果表明菌株C可溶性蛋白在相對迀移率Rf = 0.56,相對分子量 為40.0 kDa的蛋白條帶相對于菌株A和B亮度降低，菌株B，C可溶性蛋白在Rf = 0.84分子量為 22. OkDa，條帶相對于菌株A亮度增強。
[0060] 五、酯酶同工酶分析
[0061] 用直徑為lcm無菌打孔器在生長旺盛的菌絲前緣打孔取菌餅四個，接種于裝有 200ml Ml液體培養基的500ml三角瓶中，150rpm，30°C避光振蕩培養7d，無菌紗布過濾，蒸餾 水清洗3遍，用紗布擠去水分，液氮研磨至粉碎，立即稱取100mg研磨物至pH為5.6的磷酸鹽 緩沖液中振蕩混勾，12000rpm離心10min，小心吸取上清液即為樣品。使用非變性聚丙稀酰 胺凝膠電泳(Native-PAGE)，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，測試樣品以及該菌株對 應第一代原種的蛋白樣品以相同體積相同蛋白質濃度在同一塊膠上樣，上樣量為20μ1，濃 縮膠80V，分離膠150V，溴酚藍迀移至距端邊緣lcm左右時停止電泳。電泳結束前半小時進行 染色液、固定液和保存液的配制(郭曉霞.蝴蝶酯酶同工酶的系統學研究(鱗翅目、蝶亞目） [D]:陜西師范大學，2000)。電泳結束后將膠取出，去掉濃縮膠，用蒸餾水清洗后，放入染色 液，37°C染色，觀察著色情況，有清晰條帶出現時停止染色。取出凝膠，蒸餾水漂洗干凈后置 于固定液中過夜，第二天拍照并放入保存液中保存。
[0062] 根據所得圖譜，計算相對迀移率(Rf)，計算方法同可溶性蛋白分析的相對迀移率 計算方法。根據蛋白Marker的相對分子量以及各個條帶的相對迀移率，Excel數據擬合獲得 相對迀移率和蛋白質相對分子質量標準曲線。獲得標準曲線為：M =-69.1641n (R