lmg/mL溶菌酶，4 °C孵育30min，置于冰浴超聲破碎lOmin，4 °C離心收集上清液。上述裂解緩 沖液含有20mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1M NaCl，5mM咪唑，10%(g/L)甘油，pH=7.5。
[0038] (4)將（3)中達到的上清液進行鎳瓊脂糖凝膠親和層析，依次用含有20mM、40mM、 400mM咪唑的洗脫液進行梯度洗脫，將收集到的含有目的蛋白的洗脫液用飽和硫酸銨溶液 沉淀蛋白，棄去上清，沉淀用保存液溶解后，分裝保存。上述保存緩沖液含有10% (g/L)甘 油，0.1M NaCl，20mM Tris，lmM EDTA，lmM DTT，pH=7.6。
[0039] (5 )DNA底物的制備與待測化合的制備
[0040] 用退火緩沖液溶解DNA底物后，PCR儀設定程序94°C2min，每90s下降1°C，約2h后， 底物會自發形成互補雙鏈。上述退火緩沖液含有10mM Tris，50mMNaCl，lmM EDTA，pH=8.0。 室溫下將待測化合物用DMS0配成不同溶度的溶液，充分振蕩溶解后備用。
[0041 ] DNA sHdabcyl)。
[0042] (6)待測化合物樣品的篩選
[0043] 反應在96孔不透明微孔板中進行，陽性對照組2孔，每孔分別加2yL DMS0,陰性對 照組2孔，每孔分別加2yL DMS0，除陰性對照組，其余都加 Sso7d-IN。其他實驗孔分別加50μ mol/L、10ymol/L、2ymol/L、0.4ymol/L的黃苳素各2yL，用ddH2〇洗板一次，然后每孔加入2 X 反應緩沖液50yL，加入DTT 2yL，2.5yg純化的Sso7d-IN蛋白，ddH20補足體積，與Sso7d-IN在 無 MnCl2的反應緩沖液中37°C孵育30min后，每孔加入終濃度為10mmol/L的Mn2+，20pmol DNA 底物，混勻。37 °C反應2h，用酶標儀讀取RFU。同樣設置了待測化合物與DNA底物組，只加2 X 反應緩沖液50yL，20pmol DNA底物，用DMS0稀釋的50ymol/L、10ymol/L、2ymol/L、0 · 4ymol/L 的黃芩素各2yL，37°C孵育2h后用酶標儀讀取RFU。選擇激發光波長為485nm，發射光波長為 528nm。上述2 X 反應緩沖液含有40mM HEPES，200mMNaCl，50% (g/L)甘油，pH= 7.6。通過讀 值計算的黃芩素的IC5Q值為1.64μΜ。
[0044] 實施例2
[0045] 按如下步驟對HIV-lSs〇7d-IN整合酶重組蛋白進行制備及對3'加工抑制劑進行體 外篩選。以一種二酮酸抑制劑2-( 3-氯-4-氟芐基氨基)-7-羥基-6，7-二氫-5H-[ 1，7 ]二氮雜 萘-8-酮為例：
[0046] (1)將合成的Ss〇7d片段與IN基因經PCR擴增，得到所需質粒，以Pet_15b載體為基 礎構建出Ss〇7d-IN表達載體。轉入大腸桿菌BL21感受態細胞，挑取陽性克隆菌接種于5mL含 有100mg/mL氨芐的LB液體培養基，37 °C搖床振蕩培養13h得到培養物。
[0047] (2)將（1)中的培養物按體積比1 %接種于LB培養基中，37 °C搖床振蕩培養2.5h至 菌液0D值達到0.8，加入過濾滅菌的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.2mM，37 °C 搖床振蕩培養4h得到培養物。
[0048] (3)將（2)中得到的培養物離心得到沉淀，每lg沉淀用10mL裂解緩沖液重懸，加 lmg/mL溶菌酶，4 °C孵育30min，置于冰浴超聲破碎lOmin，4 °C離心收集上清液。上述裂解緩 沖液含有20mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1M NaCl，5mM咪唑，10%(g/L)甘油，pH=7.5。
[0049] (4)將（3)中達到的上清液進行鎳瓊脂糖凝膠親和層析，依次用含有20mM、40mM、 400mM咪唑的洗脫液進行梯度洗脫，將收集到的含有目的蛋白的洗脫液用飽和硫酸銨溶液 沉淀蛋白，棄去上清，沉淀用保存液溶解后，分裝保存。上述保存緩沖液含有10% (g/L)甘 油，0.1M NaCl，20mM Tris，lmM EDTA，lmM DTT，pH=7.6。
[0050] (5 )DNA底物的制備與待測化合的制備
[00511用退火緩沖液溶解DNA底物后，PCR儀設定程序94°C2min，每90s下降1°C，約2h后， 底物會自發形成互補雙鏈。上述退火緩沖液含有10mM Tris，50mMNaCl，lmM EDTA，pH=8.0。 室溫下將待測化合物用DMS0配成不同溶度的溶液，充分振蕩溶解后備用。
[0052] DNA sHdabcyl)。
[0053] (6)待測化合物樣品的篩選
[0054] 反應在96孔不透明微孔板中進行，陽性對照組2孔，每孔分別加2yL DMS0,陰性對 照組2孔，每孔分別加2yL DMS0,除陰性對照組，其余都加 Ss〇7d-IN。其他實驗孔分別加 0 · 2mg/mL、0 · 04mg/mL、0 · 008mg/mL、0 · 0016mg/mL 的 2- (3-氯-4-氟芐基氨基）-7-羥基-6，7-二氫-5H-[1，7]二氮雜萘-8-酮分別各2yL，用ddH20洗板一次，然后每孔加入2X反應緩沖液 50yL，加入DTT 2yL，2.5yg純化的Sso7d-IN蛋白，ddH20補足體積，與Sso7d-IN在無 MnCl2的反 應緩沖液中37°C孵育30min后，每孔加入終濃度為10mmol/L的Mn2+，20pmol DNA底物，混勻。 37 °C反應2h，用酶標儀讀取RFU。同樣設置了待測化合物與DNA底物組，只加2 X反應緩沖液 50yL，20pmol DNA底物，用DMS0稀釋的0·2mg/mL、0·04mg/mL、0·008mg/mL、0·0016mg/mL的2_ (3-氯-4-氟芐基氨基)-7-羥基-6，7-二氫-5H-[ 1，7 ]二氮雜萘-8-酮分別各2yL，37 °C孵育2h 后用酶標儀讀取RFU。選擇激發光波長為485nm，發射光波長為528nm。上述2 X反應緩沖液含 40mM HEPES，200mMNaCl，50%(g/L)甘油，pH = 7.6。通過讀值計算的2-(3-氯-4-氟芐基氨 基)-7-羥基-6，7-二氫-5H-[ 1，7 ]二氮雜萘-8-酮的 IC5Q 值為 12 · 4 ΙμΜ。
[0055] 實施例3
[0056] 利用與實施例2相同的操作方法測得3'加工抑制劑的IC5Q值如下：
[0057]
[0058]
【主權項】
1. 一種應用Sso7d-IN融合蛋白進行HIV-I整合酶3/加工抑制劑篩選的方法，包括W下 步驟： (nHIV-lSso7d-IN整合酶重組蛋白的制備 將合成的Sso7d基因片段與野生型整合酶（integraseJN)基因分別擴增，通過融合PCR 連接，構建Sso7d-IN表達載體，表達并純化HIV-lSso7d-IN整合酶重組蛋白，分裝保存待用； 室溫下將待測化合物樣品用二甲基亞諷(DMSO)配制成不同濃度的溶液，充分振蕩溶解后備 用； (2) DNA底物的制備 用退火緩沖液溶解DNA底物后，PCR儀設定程序94°C2min，每90s下降rC，約化后，底物 會自發形成互補雙鏈;上述退火緩沖液含有IOmM化is,50mM NaCiamM邸TA,pH=8.0; DNA底物為5'-(FAM)-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CGT GGA AAA TCT CTA GCA GT-3'-(DABCYL)； (3) 待測化合物樣品的篩選 反應在96孔不透明微孔板中進行，陽性對照組巧L，每孔分別加化L DMS0,陰性對照組2 孔，每孔分別加化L DMS0,其他孔的實驗組中加入化L不同濃度的待測化合物樣品；除陰性 對照組，其余都加 Sso7d-IN;具體操作如下:a、反應體系總體積為10化L，用dd此0洗板一次， 然后每孔加入2 X反應緩沖液50化，加入DTT 2化，2.5iig純化的Sso7d-IN整合酶重組蛋白； b、然后陽性對照組的孔和陰性對照組的孔分別化L DMS0,實驗組的其他孔加入化L用DMSO 稀釋的待測化合物;然后dd此0補足體積;C、與HIV-lSso7d-IN整合酶重組蛋白在無 MnCb的 反應緩沖液中37°C解育30min后，每孔加入終濃度為lOmmol/L的Mn2+、2化mol DNA底物，混 勻；37°C反應化，用酶標儀讀取巧光讀值;d、同樣設置了待測化合物與DNA底物組，只加2X 反應緩沖液50化、2化mol DNA底物、2化用DMSO稀釋的待測化合物，37°C解育化后用酶標儀 讀取巧光讀值；選擇激發光波長為485nm，發射光波長為528nm;上述2 X反應緩沖液含有 40mM 肥陽SJOOmM NaCl、50%(g/L)甘油，pH=7.6; (4) 按照W下公式計算待測樣品的抑制率：通過測定不同濃度下的待測化合物樣品抑制率可得出待測化合物的ICso值。2. 按照權利要求1的方法，其特征在于，由于有些待測化合物樣品對DNA巧光基團的R即 值有直接影響，會導致高濃度時待測化合物RFlK陰性對照RFU的情況，因此需要對待測化合 物RRJ進行修正，用修正后待測化合物RRJ帶入上面的公式進行計算;在上述步驟d中設置待 測化合物樣品與DNA底物組，測定化合物不同濃度下，DNA底物R即值的變化即下述公式中的 待測化合物樣品與DNA底物組RFU;修正后待測化合物RFU =待測化合物R即+(陰性對照RFU-待測化合物樣品與DNA底物組RFU)，其中待測化合物RRJ指的是步驟C中其他孔的實驗組的 待測化合物RFU。
【專利摘要】應用Sso7d-IN融合蛋白進行HIV-1整合酶3′加工抑制劑篩選的方法，屬于生物技術領域。Sso7d是一小段硫磺礦硫化葉菌DNA蛋白。Sso7d與整合酶(IN)融合表達提高IN的溶解性和活性，在純化過程中無需使用高鹽及pH值較高的緩沖液，可以更有效的催化整合體的形成以及與寡核苷酸DNA底物整合的相關過程，與IN相比，3′加工反應活性提高了5倍左右，并在抑制劑篩選過程中提高陽性與陰性值之間的差異。
【IPC分類】C12Q1/25
【公開號】CN105648031
【申請號】
【發明人】胡利明, 毛志杰, 劉偉, 劇侖
【申請人】北京工業大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年2月24日