一種應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的pcr擴增體系及文庫構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種應用于全基因組重亞硫酸鹽測序 技術中的PCR擴增體系及文庫構建方法。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化修飾是一種基因表達調控的重要手段，對個體的正常發育起至關重要 的作用，若甲基化調控機制出現問題，可使機體功能發生異常，導致一些疾病的發生，因此 DNA甲基化的檢測對一些基因相關疾病的研究具有重要意義。DNA甲基化主要發生于GC含 量較高的CpG島。甲基化測序的方法有很多種，如全基因組甲基化測序，甲基化DNA免疫共 沉淀測序，甲基結合蛋白測序，簡化甲基化測序等。
[0003] 重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-Seq)即是將Bisulfite處理與高通量測序技術相結 合，從而來繪制單堿基分辨率的DNA甲基化圖譜，用于研究特定DNA區域甲基化與特定表型 之間的關聯，為疾病發生、治療相關的研究提供研究基礎。通過全基因組重亞硫酸鹽測序 (WGBS)可以檢測甲基化狀態：DNA樣品經重亞硫酸氫鹽處理后，非甲基化的胞嘧啶（C)轉化 為尿嘧啶（U)，甲基化的胞嘧啶保持不變；鹽處理的DNA樣品經PCR擴增后，尿嘧啶（U)全 部轉化為胸腺嘧啶（T);對PCR產物進行測序，并與未處理的序列比對，檢測甲基化的位點
[0004] 在重亞硫酸鹽測序的文庫構建過程中，目的片段經重亞硫酸鹽處理后，需進行PCR 擴增。但是，按照目前常規方法，經鹽處理后大部分的DNA已破壞，純化后的DNA濃度已經很 低，經分裝每管的DNA濃度更低，導致PCR產物少，甚至達不到2100檢測濃度的最低要求。
【發明內容】
[0005] 本發明的一個目的在于提供一種應用于重亞硫酸鹽測序的PCR擴增體系，通過對 體系組成的改變，提高PCR擴增反應的產物濃度，為測序提供足夠的上機量。
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種應用于重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，該文 庫構建方法包含了利用上述的PCR擴增體系對目的片段進行擴增的步驟，使所構建的文庫 達到上機測序量的要求。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明的實施方式提供了一種應用于全基因組重亞硫酸鹽 測序的PCR擴增體系，所述擴增體系包含下述組份：
[0008] 超純水19μ 1 ;DNA模板15μ 1 ;反應緩沖液5μ 1 ;上游引物2. 5μ 1 ;下游引物 2. 5 μ 1 ;2· 5mM dNTP 5 μ 1 ;熱啟動 DNA 聚合酶 1 μ 1〇
[0009] 優選地，本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的PCR擴增 體系中，反應緩沖液為Pfu Turbo Cx反應緩沖液，熱啟動DNA聚合酶為Pfu Turbo Cx熱啟 動DNA聚合酶。
[0010] 本發明的實施方式所提供的上述應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的PCR擴增體 系，相對于常規的重亞硫酸鹽測序的PCR擴增體系，在反應體系組成的成分配比上進行了 改變，將該種體系用于重亞硫酸鹽測序過程中對目的片段進行PCR擴增，可實現提高PCR擴 增產物的濃度的目的。
[0011] 本發明的實施方式還提供了一種應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方 法，該方法包含下述步驟：
[0012] (1)將待測基因組DNA樣品片段化，然后對DNA片段進行純化；
[0013] (2)將所述DNA片段進行末端修復，得到經末端修復的DNA片段；
[0014] (3)在所述經末端修復的DNA片段的3'端添加堿基A，得到具有甲基化接頭的連 接產物；
[0015] (4)對所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，回收目的片段；
[0016] (5)將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，得到鹽處理后的目的片段；
[0017] (6)對所述鹽處理后的目的片段進行PCR擴增，得到擴增產物：
[0018] 其中，所述PCR擴增的擴增體系包含下述組份：
[0019] 超純水19μ 1 ;DNA模板15μ 1 ;反應緩沖液5μ 1 ;上游引物2. 5μ 1 ;下游引物 2. 5 μ 1 ;2· 5mM dNTP 5 μ 1 ;熱啟動 DNA 聚合酶 1 μ 1 ;
[0020] (7)分離純化所述擴增產物，得到全基因組重亞硫酸鹽測序文庫。
[0021] 優選地，在本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構 建方法中，步驟（1)中的待測基因組DNA樣品的用量為5 μ g以上，且待測基因組DNA來源 于細菌或病毒。
[0022] 優選地，在本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構 建方法中，步驟（1)中將待測基因組DNA樣品片段化時，采用超聲打斷儀對待測基因組DNA 進行打斷。
[0023] 優選地，在本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構 建方法中，步驟（4)中采用2%的瓊脂糖凝膠電泳的方法對具有甲基化接頭的連接產物進 行片段選擇。
[0024] 優選地，在本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構 建方法中，步驟（6)中對鹽處理后的目的片段進行PCR擴增時，PCR擴增反應程序為：95°C5 分鐘；98°C 30秒；以98°C 10秒、65°C 30秒、72°C 30秒為一個循環，進行12個循環；72°C 5 分鐘；最后在4 C下保存。
[0025] 優選地，在本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構 建方法中，步驟（7)中采用磁珠法對擴增產物進行分離純化。
[0026] 此外，在本發明的實施方式所提供的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建 方法中，所述的全重亞硫酸鹽測序為采用高通量測序儀進行的測序。
[0027] 本發明的實施方式所提供的上述應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方 法中，由于使用了改進的PCR擴增體系進行對目的片段的PCR擴增，達到了以下效果：（1) 使擴增后的PCR產物量有了明顯的增加，用2100芯片進行檢測，達到上機測序的要求；（2) 只用一個反應體系進行目的片段的PCR擴增，減少了擴增反應中所用到的試劑的消耗量； (3)為后續純化步驟減少工作量，很大程度上提高了工作效率。
【附圖說明】
[0028] 圖1是實施例1中對目的片段進行PCR擴增后產物的凝膠電泳圖；
[0029] 圖2是對比實驗例中采用常規方法對目的片段進行PCR擴增后產物的凝膠電泳 圖；
[0030] 圖3是用2100芯片對實施例1制備得到的測序文庫進行檢測的結果圖；
[0031] 圖4是用2100芯片對對比實驗例中采用常規方法制備得到的測序文庫進行檢測 的結果圖。
【具體實施方式】
[0032] 為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明的各實 施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發明各實施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節。但是，即使沒有這些技術細節和基 于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現本申請各權利要求所要求保護的技術方 案。
[0033] 實施例1
[0034] 本實施例所使用的試劑、試劑盒：
[0035] (1)安捷倫（Agilent):高保真 CX 熱啟動 DNA 聚合酶（Pfu Turbo cx Hotstart DNA Polymerase)
[0036] (2)德國凱杰（QIAGEN):亞硫酸氫鹽處理試劑盒（EpiTect Bisulfite Kit)
[0037] (3) Illumine DNA 建庫試劑盒（TruSeq DNA Sample Preparation Low Throughput (LT)Kit)
[0038] 1. DNA起始量定量
[0039] 注：本試驗所使用的DNA起始量為5 μ g。
[0040] 2 · DNA 片段化
[0041] (1)提前將超聲打斷儀打開降溫至6°C以下；
[0042] (2) DNA樣品（虎紋蛙病毒（TFV) DNA)用1 X TE稀釋至130 μ 1，用槍吹打混勻，轉 移全部溶液至潔凈干燥霧化杯中，打斷至200bp。
[0043] 3. DNA片段的純化
[0044] (1)在片段化的DNA中加入3倍體積的PCR-A溶液，混勻轉入純化柱每次最多 700 μ 1，lOOOOrpm 離心 lmin,棄掉廢液；
[0045] (2)加入 700 μ 1 W2 溶液，lOOOOrpm 離心 lmin,棄掉廢液；
[0046] (3)重復一次步驟（2);
[0047] (4) 12000rpm 空離 2min ;
[0048] (5)打開管蓋室溫晾3min后，將柱子轉到一個新的1. 5ml管上；
[0049] (6)加入55 μ 1 Elute