一種高靈敏度反向斑點雜交方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種反向斑點雜交方法，特別涉及一種高靈敏度反向斑點雜交方法。
【背景技術】
[0002] 斑點雜交方法首先由Kafato等發展起來，用于在固相支持物上固定幾種核酸樣 品，然后用合適的探針與已固定的樣品雜交，并由此判斷靶序列的濃度。通過估計樣品點發 射出的信號強度，與已知濃度的標準品信號強度進行比較，該方法還可以進一步確定待測 樣品中靶序列的量。應用斑點雜交方法檢測序列變異時，若靶序列內存在突變，則其擴增產 物在嚴格的條件下無法與探針雜交，無雜交信號就表示目的基因存在突變。多年來，斑點雜 交并未受到研究者的青睞，原因之一在于同一張膜上同樣的樣品雜交信號有時不穩定。此 外，正向雜交須先將PCR擴增產物固定，再與探針進行雜交，這樣就要對每個標本的擴增產 物進行固定，增加了操作步驟。
[0003] 反向斑點雜交則是由Saiki等提出的一種斑點雜交技術，該技術采用固化了多種 特異性探針的固相支持物與擴增靶序列雜交，使一次雜交即可同時篩查被檢DNA中的多種 突變。這種以固相支持物上固定探針取代固定靶核酸的方式，改變了傳統斑點雜交法一次 只能檢測一種突變的模式，具有快速、簡便、重復性好以及信號穩定的特點，尤其在基因突 變檢測、基因分型、病原體的檢測等領域有其獨特的優勢。
[0004] 現有的反向斑點雜交技術都是以硝酸纖維素膜或尼龍膜作為固相支持物，不僅易 于破碎，涉及的反應溶液和反應步驟眾多，效率較低，而且檢測待測樣品中靶序列的靈敏度 不高，分辨能力較差，容易出現假陽性和假陰性，難以滿足醫院臨床檢測的需求。
[0005] 出于這種考慮，本發明的發明人進行了研究，目的是解決相關領域現有技術所暴 露出來的問題，期望提供一種特異性高、耗時短、易操作的高靈敏度反向斑點雜交方法及其 在檢測K-ras基因突變中的應用。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的之一在于提供一種反向斑點雜交方法。該方法通過在金屬膜表面上 實現核酸雜交過程與堿性磷酸酶聯過程合二為一進行，從而可以在金屬膜表面直接形成堿 性磷酸酶標記核酸雜交體的偶聯物。本發明通過一步反應后的顯色反應，根據著色的深淺 以及雜交信號與金屬膜的強烈色差，可以用肉眼快速判斷核酸雜交的結果，極大提高了反 向斑點雜交的檢測靈敏度與分辨能力。
[0007] 本發明的又一目的在于提供所述方法在檢測K-ras基因突變中的應用。
[0008] 根據本發明的一個方面，本發明提供了一種高靈敏度反向斑點雜交方法，其包括 如下步驟：
[0009] A)將至少一種核酸探針固定在固相支持物負載的金屬膜表面；
[0010] B)利用預處理液對所述金屬膜表面進行預處理；
[0011] C)將所述核酸探針在包含堿性磷酸酶標記鏈霉親和素的雜交液中與生物素標記 的靶核酸進行一步反應；
[0012] D)步驟C)中反應完成后，利用后處理液對所述金屬膜表面進行后處理；
[0013] E)將包含底物的顯色溶液與金屬膜表面接觸進行顯色反應。
[0014] 本發明的方法在核酸探針與靶核酸雜交的過程中同步實現了堿性磷酸酶標記鏈 霉親和素與生物素的結合過程，從而可以在金屬膜表面直接形成堿性磷酸酶標記核酸雜交 體的偶聯物，不僅省去了傳統反向斑點雜交方法中在雜交反應后需要單獨進行酶聯反應的 步驟，縮短了傳統反向斑點雜交方法操作的耗時，而且促進了核酸雜交，提高了堿性磷酸酶 標記效率，使得金屬膜表面單位面積上覆蓋的堿性磷酸酶標記核酸雜交體的偶聯物的數量 大大增加，再通過顯色反應，根據著色的深淺以及雜交信號與金屬膜的強烈色差，可以用肉 眼快速判斷核酸雜交的結果，在同等條件下明顯提高了傳統核酸反向斑點雜交方法的檢測 靈敏度與分辨能力。
[0015] 根據本發明的一個具體實施例，所述金屬膜選自金膜、銀膜、銅膜和鋁膜，優選銀 膜和錯膜，所述金屬膜的厚度為l〇nm~100nm。
[0016] 金屬是一種具有光澤的物質，其對可見光強烈反射。由于堿性磷酸酶催化底物可 產生化學顯色反應，能夠在金屬膜表面產生顏色變化，從而可以通過肉眼直觀、快速地觀察 金屬膜表面核酸雜交反應前后斑點顏色的深淺，以準確判斷樣品中含有的靶核酸情況。作 為本發明的一個優選實施例，所述的金屬膜優選銀膜或鋁膜。納米級的銀膜或鋁膜能夠呈 現較好的反光性能，可以明顯提高顯色反應后檢測靶核酸的分辨能力。此外，金屬膜還結實 耐用，易于清洗，容易去除雜交背景。
[0017] 根據本發明的一個具體實施例，所述固相支持物選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、硅 片、載玻片或塑料片，優選塑料片，更優選環烯烴共聚物塑料片。
[0018] 環烯烴共聚物是一種由環烯烴與α -烯烴聚合而成的高附加值熱塑性工程塑料， 具有很高的透明度。本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，環烯烴共聚物塑料 表面能夠很好地與金屬膜結合，不僅金屬膜不容易從塑料表面脫落，而且反光性能非常好， 在其表面負載一層納米厚度的金屬膜后，堿性磷酸酶催化底物的顯色反應效果更為明顯， 可以進一步提高本發明中的方法檢測靶核酸的靈敏度與分辨能力。
[0019] 根據本發明的一個優選實施例，負載有金屬膜的固相支持物在使用前被真空封 裝。
[0020] 在本發明的方法中，金屬膜負載到固相支持物表面的方法以及核酸探針在金屬膜 表面的固定方法均在本領域技術人員的知識范圍內。作為一個優選的實施例，金屬膜可以 通過真空鍍膜的方法蒸鍍到固相支持物表面，核酸探針可以通過末端連接的巰基基團與金 屬膜實現固定連接。
[0021 ] 在本發明的方法中，所述堿性磷酸酶是一種同源二聚體蛋白，是一種含鋅的金屬 酶。每分子酶至少含2個Ζη原子。酶上包含3種類型的金屬結合位點，即所謂的催化結合 位點、結構結合位點和調節結合位點。其中兩個催化結合位點的結合則只會導致一個亞單 位的磷酸化，即負協作亞單位之間發生相互作用。
[0022] 在本發明的方法中，所述生物素有兩個環狀結構I和II。其中，I環為咪唑酮環， 是其與鏈霉親和素結合的主要部位；II環為噻吩環，C 2上有一戊酸側鏈；生物素分子通過 其末端的羧基與本發明所述的靶核酸連接，從而標記在靶核酸分子上。
[0023] 在本發明的方法中，所述鏈霉親和素是由鏈霉菌分泌的一種蛋白質，其分子由4 條相同的肽鏈組成，每條肽鏈都能結合一個生物素，因此每個鏈霉親和素分子能結合4個 生物素分子。此外，每條肽鏈的氨基酸組成中，甘氨酸和丙氨酸的含量較大，肽鏈中的色氨 酸殘基是連接生物素的活性基團。所述鏈霉親和素與生物素二者親和結合的常數（K)為 1015L/mol。在本發明的方法中，靶核酸與核酸探針雜交的同時，鏈霉親和素與生物素也進 行親和結合，因此雜交液中的堿性磷酸酶標記鏈霉親和素分子與固定在固相支持物表面的 核酸探針分子在一步反應中競爭性結合生物素標記的靶核酸分子。
[0024] 本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，本發明的方法將所述堿性磷酸 酶標記鏈霉親和素直接加入到雜交液中，一方面能夠使得堿性磷酸酶標記鏈霉親和素與生 物素標記靶核酸充分的結合；另一方面還能夠促進核酸雜交效率，縮短核酸雜交反應的時 間。
[0025] 根據本發明的一個具體實施例，步驟C)中所述堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜 交液中的濃度為〇· 05~2 μ g/ml，優選0· 1~1. 5 μ g/ml，更優選0· 5~1. 2 μ g/ml。在 本發明的方法中，可以列舉的所述堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度包括但不 限于：〇· 05 μ g/ml、0. 06 μ g/ml、0. 07 μ g/ml、0. 08 μ g/ml、0. 09 μ g/ml、0. 1 μ g/ml、0. 2 μ g/ ml、0. 3μ g/ml、0. 4μ g/ml、0. 5μ g/ml、0. 6μ g/ml、0. 7 μ g/ml、0. 8μ g/ml、0. 9μ g/ml、 1 μ g/ml、L 1 μ g/ml、L 2 μ g/ml、L 5 μ g/ml 和 2 μ g/ml 〇
[0026] 在本發明的方法中，所述堿性磷酸酶標記鏈霉親和素在雜交液中的濃度是本發明 的重要方面。本發明的發明人經過大量試驗與創造性勞動發現，如果堿性磷酸酶標記鏈霉 親和素在雜交液中的濃度過低，那么影響靶核酸檢測的靈敏度；如果堿性磷酸酶標記鏈霉 親和素在雜交液中的濃度過高，那么容易帶來非特異性吸附現象，影響靶核酸檢測結果的 準確性。
[0027] 根據本發明的一個具體實施例，步驟B)中所述預處理液包括胱胺、脂肪醇聚氧乙 烯醚和異構醇；其中，所述脂肪醇聚氧乙烯醚選自C 17~C19的脂肪醇聚氧乙烯醚，所述異構 醇選自Q。~C13異構醇。
[0028] 根據本發明的一個具體實施例，在所述預處理液中，胱胺為3~20重量份，脂肪醇 聚氧乙烯醚為2~18重量份以及異構醇為0. 2~9重量份；優選地,胱胺為5~10重量 份，脂肪醇聚氧乙烯醚為3~12重量份以及異構醇為2~8重量份。
[0029] 本發明的發明人經過大量實驗與創造性勞動發現，胱胺與脂肪醇聚氧乙烯醚在預 處理液中協同配合作用，不僅能夠有效封閉金屬膜表面的非特異性活性位點，提高檢測的 特異性，而且能夠在金屬膜表面形成一層保護層，有效防止使用中的金屬膜表面被氧化。本 發明采用高碳原子數的異構醇，一方面可以提高胱胺的溶解性，使其獲得較高的增容參數 與分子自組裝活性能力，另一方面可以提高胱胺與脂肪醇聚氧乙烯醚在固相支持物表面的 吸附效果。
[0030] 根據本發明的一個具體實施例，步驟B)中所述預處理是將所述固相支持物浸泡 在25~37°C溫度的所述預處理液中30~60min。
[0031] 預處理液的溫度以及固相支持物在其中的浸泡時間直接影響胱胺與脂肪醇聚氧 乙烯醚在固相支持物表面的吸附效果。溫度較低或浸泡時間較短，吸附效果較差；溫度過高 或浸泡時間過長，不僅吸附在固相支持物表面的靶DNA構象變化，影響后期核酸雜交效率， 而且固相支持物表面負載的金屬膜有可能會脫落。本發明的發明人通過大量試驗與創造性 勞動發現，將所述固相支持物浸泡在25~37°C的所述預處理液中30~60min，預處理效果 較好。
[0032] 根據本發明的一個具體實施例，步驟C)中所述雜交液包括鋅離子、鎂離子、表面 活性劑和陽離子型