[0127] (13)加入3倍體積（120 μ 1)的PCR-A溶液，混勻轉入新的純化柱，lOOOOrpm離心 lmin,棄掉廢液；
[0128] (14)加入 700 μ 1 W2 溶液，lOOOOrpm 離心 lmin,棄掉廢液；
[0129] (15)重復一次步驟（14);
[0130] (16) 12000rpm 空離 2min ;
[0131] (17)打開管蓋室溫晾3min后，將柱子轉到一個新的1. 5ml管上；
[0132] (18)加入17 μ 1 Elute溶液，蓋上柱子管蓋，室溫孵育2min ;
[0133] (19) 12000rpm離心2min，棄掉柱子，蓋緊管蓋。
[0134] 10. PCR 擴增
[0135] (1)反應體系：
[0136]
[0137] (2)擴增條件：
[0138] a 95 °C for 5min
[0139] b 98°C for 30s
[0140] c 12cycles of:
[0141] 98°C for 10s
[0142] 65°C for 30s
[0143] 72°C for 30s
[0144] d 72 °C for 5min
[0145] e Hold at 4°C
[0146] 11. AMPure XP Beads 純化
[0147] (1)將AMPure XP Beads震蕩均勻，取50 μ 1至產物PCR管中，調槍至100 μ 1，上 下吹打10次混勻，室溫孵育15min ;
[0148] (2)將PCR管置磁力架上，室溫孵育5min，珠子吸附成團，溶液變透明，用槍將上清 液移去，不要碰到珠子；
[0149] (3)加入200 μ 1 80%的乙醇，室溫孵育30s，棄掉廢液；
[0150] (4)重復步驟（3) -次；
[0151] (5)保持PCR管在磁力架上，室溫孵育10-15min，觀察到珠子有裂紋后，將PCR管 取下；
[0152] (6)加入32. 5 μ IResuspension Buffer,用槍上下吹打10次混勻，蓋好管蓋，室溫 孵育2min ;
[0153] (7)將PCR管置于磁力架上，室溫孵育5min，溶液變透明；
[0154] (8)轉移30μ 1上清液至新PCR管中，保存于_20°C。
[0155] 12.文庫檢測及定量
[0156] (1)1%凝膠電泳檢測：取3μ 1文庫跑膠檢測，其電泳圖見附圖1。
[0157] (2)濃度檢測：用TBS 380檢測濃度。
[0158] (3)質量檢測：取1 μ 1文庫用2100芯片進行檢測，檢測結果如附圖3所示。
[0159] 實施例2對比試驗例
[0160] 采用常規方法制備用于全基因組重亞硫酸鹽測序的甲基化文庫，其余步驟與實施 例1中相同，區別在于操作步驟10,即PCR擴增時，采用下述常規的PCR擴增體系：
[0161] 將12 μ 1經鹽處理且純化后的DNA分裝于3個PCR管，每管反應體系為：
[0162] DNA 4 μ 1
[0163] Ultra Pure Water 33. 75 μ 1
[0164] Pfu Turbo Cx Reaction Buffer 5 μ 1
[0165] 10 mM dNTP Mix 1. 25μ 1
[0166] PCR Primer Cocktail 5 μ 1
[0167] PfuTurbo Cx Hotstart DNA Polymerase 1 μ 1
[0168] Total Volume 50 μ 1
[0169] 對PCR產物進行凝膠電泳檢測，其電泳圖參見附圖2 ;同樣使用2100芯片對采用 上述常規方法所值得文庫進行檢測，檢測結果如附圖4所示。
[0170] 從附圖1和附圖3的對比可以看出：在附圖1中明顯出現了 PCR擴增產物的電泳 條帶，而附圖3中則并沒有PCR擴增產物的電泳條帶。
[0171] 此外，從附圖2和附圖4的對比可以看出：附圖2為實施例1中以本發明所提供 PCR擴增體系進行擴增后的檢測結果，出現明顯的目的峰值（273)，附圖4為按常規體系擴 增的檢測結果，未出現相應的目的峰值。因此，常規體系擴增得到的PCR產物濃度較低，不 足以滿足最低上機測序量；而實施例1中根據本發明所獲得的PCR產物的濃度有顯著提高， 滿足后續測序步驟中的上機測序量。
[0172] 本領域的普通技術人員可以理解，上述各實施方式是實現本發明的具體實施例， 而在實際應用中，可以在形式上和細節上對其作各種改變，而不偏離本發明的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的PCR擴增體系，其特征在于，所述擴增體系 包含下述組份： 超純水19 μ 1 ;DNA模板15 μ 1 ;反應緩沖液5 μ 1 ;上游引物2. 5 μ 1 ;下游引物2. 5 μ 1 ; 2. 5mM dNTP5 μ 1 ;熱啟動 DNA 聚合酶 1 μ 1。2. 根據權利要求1所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的PCR擴增體系，其特征在 于，所述反應緩沖液為Pfu Turbo Cx反應緩沖液，所述熱啟動DNA聚合酶為Pfu Turbo Cx 熱啟動DNA聚合酶。3. -種應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在于，包含下述步 驟： (1) 將待測基因組DNA樣品片段化，然后對DNA片段進行純化； (2) 將所述DNA片段進行末端修復，得到經末端修復的DNA片段； (3) 在所述經末端修復的DNA片段的3'端添加堿基A，得到具有甲基化接頭的連接產 物； (4) 對所述具有甲基化接頭的連接產物進行片段選擇，回收目的片段； (5) 將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，得到鹽處理后的目的片段； (6) 對所述鹽處理后的目的片段進行純化，然后進行PCR擴增，得到擴增產物： 其中，所述PCR擴增的擴增體系包含下述組份： 超純水19 μ 1 ;DNA模板15 μ 1 ;反應緩沖液5 μ 1 ;上游引物2. 5 μ 1 ;下游引物2. 5 μ 1 ; 2. 5mM dNTP5 μ 1 ;熱啟動 DNA 聚合酶 1 μ 1 ; (7) 分離純化所述擴增產物，即得到全基因組重亞硫酸鹽測序文庫。4. 根據權利要求3所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在 于，所述步驟（1)中的待測基因組DNA樣品的用量為5yg以上。5. 根據權利要求3所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在 于，所述步驟（1)中的待測基因組DNA來源于細菌或病毒。6. 根據權利要求3所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在 于，所述步驟（1)中將待測基因組DNA樣品片段化時，采用超聲打斷儀對待測基因組DNA進 行打斷。7. 根據權利要求3所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在 于，所述步驟（4)中采用2%的瓊脂糖凝膠電泳的方法對具有甲基化接頭的連接產物進行 片段選擇。8. 根據權利要求3所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在 于，所述步驟（6)中對純化后的目的片段進行PCR擴增時，PCR擴增反應程序為：95°C 5分 鐘；98°C 30秒；以98°C 10秒、65°C 30秒、72°C 30秒為一個循環，進行12個循環；72°C 5分 鐘；最后在4 C下保存。9. 根據權利要求3所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構建方法，其特征在 于，所述步驟（7)中采用磁珠法對擴增產物進行分離純化。10. 根據權利要求3至9中的任一項所述的應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的文庫構 建方法，其特征在于，所述的全基因組重亞硫酸鹽測序為采用高通量測序儀進行的測序。
【專利摘要】本發明涉及分子生物學技術領域，公開了一種應用于全基因組重亞硫酸鹽測序的PCR擴增體系及文庫構建方法。該PCR擴增體系包含下述組份：超純水19μl；DNA模板15μl；反應緩沖液5μl；上游引物2.5μl；下游引物2.5μl；2.5mM？dNTP？5μl；熱啟動DNA聚合酶1μl。將該種PCR擴增體系用于全基因組重亞硫酸鹽測序過程中對鹽處理后的目的片段的PCR擴增步驟，可提高PCR擴增反應的產物濃度，為測序提供足夠的上機量。本發明也提供包含上述PCR擴增步驟的重亞硫酸鹽測序文庫構建方法，該方法可構建足夠上機量的甲基化測序文庫，有助于全基因組重亞硫酸鹽測序的順利進行。
【IPC分類】C12Q1/68, C40B50/06
【公開號】CN105648040
【申請號】
【發明人】孫子奎, 高文學, 丁方美, 王 鋒, 何再平
【申請人】上海派森諾生物科技有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月11日