FP-YEATS4-siRNA 能 夠顯著下調YEATS4基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒（lentivirus，簡寫 為Lv)作為基因操作工具攜帶RNA i載體pGCS IL-GFP-YEATS4-S i RNA能夠靶向地將針對 YEATS4基因的RNAi序列高效導入人結腸癌RK0細胞，降低YEATS4基因的表達水平，顯著抑 制上述腫瘤細胞的增殖能力。因此慢病毒介導的YEATS4基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床 非手術治療方式。
[0064] 本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性 抑制人YEATS4基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中 YEATS4基因的表達，促進細胞凋亡、降低腫瘤細胞的侵襲和轉移能力等，進而抑制腫瘤細胞 的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【附圖說明】
[0065] 圖 1 :pGCSIL_GFP 質粒 DNA 圖譜
[0066] 圖2 :YEATS4-RNAi慢病毒侵染結腸癌細胞4天后，YEATS4mRNA的表達水平顯著降 低
[0067] 圖3 :YEATS4_RNAi慢病毒侵染結腸癌細胞4天后，引起細胞增殖抑制
【具體實施方式】
[0068] 本發明涉及了一組針對人YEATS4基因的小分子干擾RNA(siRNA)序列、RNA干擾 載體和RNA干擾慢病毒。選取人YEATS4mRNA編碼區序列作為siRNA的靶位點，根據靶位點 中連續的10-30(優選15-27,更優選19-23)個堿基序列設計siRNA靶點序列。通過基因克 隆，構建表達上述siRNA的核酸構建體，包裝表達上述siRNA的慢病毒。細胞實驗證明，上 述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細胞中內源YEATS4基因的表達。
[0069] 本發明的發明人經過廣泛而深入的研究發現，在腫瘤組織中，YEATS4基因顯著高 表達；發明人發現，采用RNAi方法下調人YEATS4基因的表達后可有效地抑制腫瘤細胞的增 殖、促進細胞凋亡、降低腫瘤細胞的侵襲和轉移能力等，可以有效地控制腫瘤的生長進程， 這一研究成果表明YEATS4基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發明人進一步合成和 測試了多種針對YEATS4基因的siRNA，篩選出了可有效抑制YEATS4的表達進而抑制結腸癌 RK0細胞增殖和生長的siRNA，在此基礎上完成了本發明。
[0070] 本發明提供了一系列干擾人YEATS4基因的小干擾RNA (siRNA)序列，構建了可特 異性沉默YEATS4基因表達的慢病毒。本發明研究發現，針對人YEATS4基因設計的小干擾 RNA及RNAi慢病毒，穩定并特異地下調YEATS4基因的表達，并有效地抑制人腫瘤細胞的增 殖。本發明表明YEATS4基因可促進腫瘤細胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。 而且，通過RNAi方式沉默YEATS4基因的表達，可作為抑制腫瘤發展的有效手段。
[0071] 本發明的設計思路為：
[0072] 本發明通過如下方法來篩選獲得一種人YEATS4基因 RNAi慢病毒：從Genbank中 調取人YEATS4基因序列；預測siRNA位點；合成針對YEATS4基因的有效的siRNA序列、 兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ;慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構 建表達YEATS4基因 siRNA序列的RNAi質粒；將RNAi質粒和慢病毒包裝需要的輔助載體 (Packing Mix, Sigma-aldrich公司）共轉染人胚腎細胞293T，產生重組慢病毒顆粒，即可 制得高效沉默YEATS4基因的慢病毒。
[0073] 基于上述方法，本發明提供了 5個干擾YEATS4基因的有效靶點（具體如SEQ ID NO :1-5所示），構建了特異干擾人YEATS4基因的慢病毒。
[0074] 同時本發明還公開一種人YEATS4基因 RNAi慢病毒（YEATS4-RNAi)及其制備與應 用。
[0075] 本研究發現，利用慢病毒介導的RNAi方法，在降低YEATS4基因在腫瘤細胞中的表 達后，可以有效抑制腫瘤細胞的增殖。本研究表明，YEATS4基因是一個原癌基因，可促進腫 瘤細胞增殖，在腫瘤發生和發展中具有重要的生物學功能，YEATS4基因可以為腫瘤治療的 靶標，慢病毒介導的YEATS4基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。
[0076] 下面結合實施例進一步闡述本發明。應理解，實施例僅用于說明本發明，而非限制 本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規條 件，如[美]Sambr 〇〇k.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科學出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進行或配置。
[0077] 實施例1針對人YEATS4基因 RNAi慢病毒的制備
[0078] 1.篩選針對人YEATS4基因的有效的siRNA靶點
[0079] 從Genbank調取YEATS4基因信息；設計針對YEATS4基因的有效的siRNA靶點。 表1列出了其中5條針對YEATS4基因的有效siRNA靶點序列。
[0080] 表1靶向于人YEATS4基因的siRNA靶點序列
[0081]
[0082]
[0083] 2.慢病毒載體的制備
[0084] 針對siRNA靶點（以SEQ ID N0 :1為例）合成兩端含Age I和EcoR I酶切位點 粘端的雙鏈DNA Oligo序列（表2);以Age I和EcoR I限制性內切酶作用于pGCSIL-GFP 載體（上海吉凱基因化學技術有限公司提供，圖1)，使其線性化，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切 片段。
[0085] 表2兩端含Age I和EcoR I酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo
[0086]
[0087] 通過T4DNA連接酶將雙酶切線性化（酶切體系如表4所示，37°C，反應lh)的載 體DNA和純化好的雙鏈DNA Oligo連接，在適當的緩沖體系（連接體系如表5所示）中 于16°C連接過夜，回收連接產物。將連接產物轉化氯化鈣制備的新鮮的大腸桿菌感受態 細胞（轉化操作參考：分子克隆實驗指南第二版55-56頁）。在連接轉化產物長出菌克 隆表面沾一下，溶于10 μ 1 LB培養基，混勻取1 μ 1作為模板；在以慢病毒載體中RNAi序 列的上下游，設計通用PCR引物，上游引物序列：5' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'（SEQ IDN0:10);下游引物序列 ：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'（SEQIDN0:11)，進行PCR鑒 定實驗（PCR反應體系如表6-1，反應條件如表6-2)。對PCR鑒定陽性的克隆進行測序和 比對分析，比對正確的克隆即為構建成功的針對SEQ ID N0 :1的表達RNAi的載體，命名為 pGCSIL-GFP-YEATS4-S i RNA。
[0088] 構建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA陰性對照質粒，陰性對照siRNA靶序列為 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SEQ ID N0:12)。構建 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 陰性對照質 粒時，針對Scr siRNA靶點合成兩端含Age I和EcoR I酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo序 列（表3)，其余構建方法、鑒定方法及條件均同pGCSIL-GFP-YEATS4-siRNA。
[0089] 表3兩端含Age I和EcoR I酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo
[0090]
[0092] 通過T4DNA連接酶將雙酶切線性化（酶切體系如表4所示，37°C，反應lh)的載體
[0093] 表4pGCSIL_GFP質粒酶切反應體系
[0094]
[0095] 表5載體DNA和雙鏈雙鏈DNA 01 igo連接反應體系
[0096]
[0097] 表6-1PCR反應體系
[0098]
[0099] 表6-2PCR反應體系程序設定
[0100]
[0101] 3.包裝 YEATS4-siRNA 慢病毒
[0102] 以Qiagen公司的質粒抽提試劑盒提取RNAi質粒pGCSIL-GFP-YEATS4-siRNA的 DNA，配制成lOOng/μ 1儲存液。
[0103] 轉染前24h，用胰蛋白酶消化對數生長期的人胚腎細胞293T細胞，以含10%胎牛 血清的DMEM完全培養基調整細胞密度為1. 5 X 105細胞/ml，接種于6孔板，37°C，5 % C02培 養箱內培養。待細胞密度達70%-80%時即可用于轉染。轉染前2h，吸出原有培養基，加入 1.5ml 新鮮的完全培養基。按照 Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix 試劑盒的說明，向一滅菌離心管中加入Packing Mix (PVM) 20 μ 1，PEI 12 μ 1，無血清DMEM 培養基400 μ 1，取20 μ 1上述抽提的質粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
[0104] 將上述轉染混和物在室溫下孵育15min，轉移至人胚腎細胞293T細胞的培養基 中，37°C，5% C02培養箱內培養16h。棄去含有轉染混和物的培養介質，PBS溶液洗滌，加入 完全培養基2ml。由于慢病毒載體自身帶有綠色熒光蛋白的報告基因，24h后可置于熒光 顯微鏡下觀察兩組細胞GFP的表達情況，確定慢病毒質粒是否已被293T細胞包裝。繼續培 養48h后，收集細胞上清液，Centricon Plus-20離心超濾裝置（Millipore)純化和濃縮慢 病毒，步驟如下：（1) 4°C，4000g離心10min，除去細