胞碎片；（2) 0. 45 μ m濾器過濾上清液于 40ml超速離心管中；(3)4000g離心，10-15min，至需要的病毒濃縮體積；(4)離心結束后， 將過濾杯和下面的濾過液收集杯分開，將過濾杯倒扣在樣品收集杯上，離心2min離心力不 超過l〇〇〇g; (5)把離心杯從樣品收集杯上移開，樣品收集杯中的即為病毒濃縮液。將病毒 濃縮液分裝后于-80攝氏度保存。病毒濃縮液中含有的siRNA的第一鏈的序列如SEQ ID NO: 18所示。對照慢病毒的包裝過程同YEATS4-siRNA慢病毒，僅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 載體代替 pGCSIL-GFP-YEATS4-siRNA 載體。
[0105] 實施例2實時熒光定量RT-PCR法檢測YEATS4基因的沉默效率
[0106] 處于對數生長期的結腸癌RK0細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液（細胞數約為 5父10 4/1111)接種于6孔板中，培養至細胞融合度達到約30%。根據侵染復數（101，服0:10) 值，加入適宜量的實施例1制備的病毒，培養24h后更換培養基，待侵染時間達到4天后，收 集細胞。根據Invitrogen公司的Trizol操作說明書，抽提總RNA。根據Promega公司的 M-MLV操作說明書，將RNA逆轉錄獲得cDNA(逆轉錄反應體系見表7,42°C反應lh，然后在 70°C水浴鍋中水浴10min使逆轉錄酶失活）。
[0107] 采用TP800型Real time PCR儀（TAKARA)進行實時定量檢測。YEATS4基因 的引物如下：上游引物 5 ' -TCATAGAACTCTGAAACCACTGTC-3 '（SEQ ID N0 :13)和下游引 物 5' -CCTGTAACCCTGTATCATTTGCTA-3'（SEQ ID NO :14)。以管家基因 GAPDH 為內參， 引物序列如下：上游引物5 ' -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3 '（SEQ ID NO : 15)和下游引物 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'（SEQ ID N0:16)。按表 8 中的比例配置反應體系。
[0108] 表7逆轉錄反應體系
[0109]
[0110] 表 8Real_time PCR 反應體系
[0111]
[0112] 設定程序為兩步法Real-time PCR :預變性95°C，15s ;之后每一步變性95°C，5s ; 退火延伸60°C，3〇S;共進行45個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。PCR結束后，95°C變 性lmin，然后冷卻至55°C，使DNA雙鏈充分結合。從55°C開始到95°C，每一步增加0. 5°C， 保持4s，同時讀取吸光值，制作熔解曲線。采用2-Δ 分析法計算侵染了 YEATS4mRNA的表 達豐度。侵染對照病毒（Lv-Scr-siRNA)的細胞作為對照。實驗結果（圖2)表明，結腸癌 RK0細胞mRNA的表達水平下調了 62. 9%。
[0113] 實施例3檢測侵染了 YEATS4_siRNA慢病毒的腫瘤細胞的增殖能力
[0114] 處于對數生長期的結腸癌RK0細胞進行胰酶消化，制成細胞懸液（細胞數約為 5 X 104/ml)接種于6孔板中，培養至細胞融合度達到約30 %。根據侵染復數（Μ0Ι，RK0 :10)， 加入適宜量的病毒，培養24h后更換培養基，待侵染時間達到4天后，收集處于對數生長期 的各實驗組細胞。完全培養基重懸成細胞懸液（2 X 104/ml)，以細胞密度約為2000個/孔， 接種96孔板。每組5個復孔，每孔100μΙ。鋪好板后，置37°C、5%C0 2培養箱培養。從鋪 板后第二天開始，每天用Cellomics儀器（Thermo Fisher)檢測讀板一次，連續檢測讀板5 天。通過調整Cellomics arrayscan的輸入參數，準確地計算出每次掃描孔板中的帶綠色 熒光的細胞的數量，對數據進行統計繪圖，繪出細胞增殖曲線（結果如圖3)。結果表明，慢 病毒侵染組各腫瘤在細胞體外培養5天后，增殖速度顯著減緩，遠低于對照組腫瘤細胞的 增殖速度，活力細胞數目分別下降了 67. 9%，表明YEATS4基因沉默導致腫瘤細胞增殖能力 被抑制。
[0115] 以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明任何形式上和實質上的限制， 應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還將可以做出 若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。凡熟悉本專業的技術人員， 在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術內容而做出的些許更 動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對 上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發明的技術方案的范圍 內。
【主權項】
1. 一種分離的人YEATS4基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物 中的用途。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自結腸癌。3. -種降低腫瘤細胞中YEATS4基因表達的分離的核酸分子，所述核酸分子包含： a) 雙鏈RNA，所述雙鏈RNA中含有能夠在嚴緊條件下與YEATS4基因雜交的核苷酸序 列；或者 b) shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與YEATS4基因雜交的核苷酸序列。4. 如權利要求3所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA包含第一鏈和第二 鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與YEATS4 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所 述正義鏈片段的序列與YEATS4基因中的靶序列基本相同。5. 如權利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述YEATS4基因的靶序列含 有SEQ ID NO: 1-5的序列。6. 如權利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA為小干擾RNA， 該小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :17所示。7. 如權利要求3或4所述分離的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQ ID NO :18所示。8. -種YEATS4基因干擾核酸構建體，含有編碼權利要求3-7任一權利要求所述分離的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表達所述shRNA。9. 如權利要求8所述YEATS4基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述YEATS4基因干擾 核酸構建體為干擾慢病毒載體。10. 如權利要求9所述YEATS4基因干擾核酸構建體，其特征在于，所述干擾慢病毒載體 由將編碼所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，所述慢病毒載體選自： pLKO. l-puro、pLK0. l-CMV-tGFP、pLKO.l-pur〇-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、 pLKO. l-Neo、pLK0. l-Ne〇-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagYFP、pLKO. l-pur〇-CMV-TagRFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagFP635、 pLKO.l-pur〇-UbC-TurboGFP> pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635> pLK〇-pur〇-IPTG-lxLacO> pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任 o11. 一種YEATS4基因干擾慢病毒，由權利要求9-10任一權利要求所述干擾慢病毒載體 在慢病毒包裝質粒、細胞系的輔助下，經過病毒包裝而成。12. -種用于預防或治療腫瘤的藥物組合物，其有效物質含有權利要求3-7任一權利 要求所述的分離的核酸分子，權利要求8-10任一權利要求所述YEATS4基因干擾核酸構建 體，和/或權利要求11所述的YEATS4基因干擾慢病毒，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑 或賦形劑。13. 權利要求12所述藥物組合物在制備治療結腸癌的腫瘤治療藥物中的應用。14. 一種用于降低腫瘤細胞中YEATS4基因表達的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括：存在于容器中的，權利要求3-7任一權利要求所述的分離的核酸分子，權利要求8-10任 一權利要求所述YEATS4基因干擾核酸構建體，和/或權利要求11所述的YEATS4基因干擾 慢病毒。
【專利摘要】本發明公開了人YEATS4基因的用途及其相關藥物。本發明公開了人YEATS4基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發明還進一步構建了人YEATS4基因小分子干擾RNA、人YEATS4基因干擾核酸構建體、人YEATS4基因干擾慢病毒并公開了它們的用途。本發明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構建體、慢病毒能夠特異性抑制人YEATS4基因的表達，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細胞，高效率地抑制靶細胞中YEATS4基因的表達，進而抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤細胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【IPC分類】C12N15/867, C12Q1/68, A61K31/713, A61P35/00, C12N15/113
【公開號】CN105648042
【申請號】
【發明人】譚暢, 王小霞, 沈克, 沈浩, 金楊晟, 曹躍瓊
【申請人】上海吉凱基因化學技術有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月12日