增陰性樣本。
[0030] 由于RPA擴增速度非常迅速，傳統PNA利用方法(PNA直接加入到反應體系中，以抑 制非特異性片段擴增)很難在RPA擴增中實現(如本發明實施例5所述方法的圖5結果顯示： 即便加入PNA，但是如果沒有預先使PNA與非靶序列結合，即預先使PNA與樣本99°C解鏈 2min，66°C結合2min，（即便再加上另外的錯配堿基），其結果還是陽性和陰性多態性細胞系 均顯示綠色熒光，電泳結果也顯示假陽性，（即都有單條帶產生），本發明利用PNA-DNA結合 溫度高于DNA-DNA結合溫度的特點（在此實驗中，相同長度寡核酸引物DNA與模板DNA結合溫 度低于相同長度寡PNA與模板DNA結合溫度約10°C左右），將PNA成功用于檢測篩選單個核苷 酸多態性的方法中。
[0031] 本發明(ARPS)總結出一套標準化流程和陰陽質控（以細胞株DNA為質控品）的篩選 人類基因多態性的方法:濃度為20μΜ的PNA溶解液2yL，300ng樣本DNA，濃度為10μΜ的引物溶 解液各2yL，擴增時間為15min，再加入濃度為200X的SYBR GreenI(Solarbio，北京，索萊寶 科技有限公司，每20yL產物應用UiL)，以上考慮到敏感性和特異性的平衡。由于擴增體系已 經確立，即只需要加入已知濃度的樣本DNA即可在15min內篩選出其有無相應的基因多態 性。篩選不同的目的靶基因只需要調整相應引物和PNA。
【附圖說明】
[0032]圖1表示篩選的具有很好的特異性的EGFR19號染色體的引物。從左至右依次顯示 了陽性對照組(細菌DNA，143bp目的片段）、陰性對照組(無樣本DNA)、擴增時間為20min的19 號染色體缺失陽性細胞系（HCC827細胞系，目的片段266bp)的DNA樣本個和陰性細胞系 (A549細胞系）DNA樣本、15min的19號染色體缺失陽性細胞系（HCC827細胞系，266bp)DNA和 陰性細胞系(A549細胞系)DNA、10min的19號染色體缺失陽性細胞系(HCC827細胞系，266bp) DNA和陰性細胞系(A549細胞系)DNA和5min的19號染色體缺失陽性細胞系(HCC827細胞系， 266bp)DNA和陰性細胞系(A549細胞系^NAiP管上面標記了結果的顏色，各個時間段都產 出了特異性的目的片段。
[0033]圖2表示篩選EGFRL858R多態性中設計的引物的特異性。從左至右依次顯示了陽性 對照組(細菌DNA，143bp目的片段）、陰性對照組(無樣本DNA)、擴增時間為lOmin的L858R陽 性細胞系（H1975細胞系，目的片段201bp)DNA和陰性細胞系（A549細胞系）DNA、15min的 L858R陽性細胞系（H1975細胞系，201bp)DNA和陰性細胞系(A549細胞系）DNA、20min的L858R 陽性細胞系（H1975細胞系，201bp)DNA和陰性細胞系(A549細胞系）DNA和5min的L858R陽性 細胞系(H1975細胞系，201bp)DNA和陰性細胞系(A549細胞系^NAiP管上面標記了結果的 顏色，10min-20min都特異性的擴增了目的片段。5min時間不適用于此篩選。
[0034] 圖3顯示ARPS篩選的靈敏度：
[0035] A:篩選19號染色體缺失（2)的特定引物與經過稀釋的HCC-827細胞系的基因組DNA 反應。HCC-827細胞系DNA的稀釋液，30%以上的陽性細胞系(HCC-827細胞系）
[0036] DNA用ARPS或電泳均可檢測出結果（肉眼可見的綠色熒光和單一目的條帶）；
[0037] B:篩選L858R點多態性特異性引物與經過稀釋的H-1975細胞系的基因組DNA反應。 H-1975細胞系DNA的稀釋液，40%以上的陽性細胞系(!1-1975細胞系)0嫩用八1^或電泳均可 檢測出結果（肉眼可見的綠色熒光和單一目的條帶）。
[0038]圖4篩選冰凍組織樣本中的基因多態性：
[0039] A:顯示篩選的冰凍組織樣本中EGFR19Del(2)型基因多態性的情況。從上至下依次 陽性質控(HCC827細胞系DNA，經實施例1確定為有此基因多態性的DNA)、陰性質控(A549細 胞系DNA，經驗證無此基因多態性的DNA)、一個經過直接測序法篩選驗證過的冰凍組織多態 性樣本、兩個經過直接測序篩選過的冰凍組織非多態性樣本。（左邊為本發明篩選結果，右 邊為直接測序驗證結果）左邊結果(本發明肉眼可見檢測結果)從上至下依次為多態性陽性 (質控，綠色）、多態性陰性（質控，黃色）、多態性陽性（樣本，綠色）、多態性陰性（樣本，黃 色）、多態性陰性(樣本，黃色）；右邊(直接測序)結果從上至下依次為陽性對照；陰性對照； 樣本1測序結果：TCGCTATCAAG (此處缺失15個堿基）ACATCTCCG;樣本5測序結果： TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG;樣本 6 測序結果:TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCG。（劃 線字母為未缺失的15個喊基序列）。
[0040]圖4B:顯示篩選的冰凍組織樣本中EGFRL858R基因多態性的情況。從上至下依次為 陽性質控(H1975細胞系DNA經實施例2確定為有此基因多態性的DNA)、陰性質控(A549細胞 系DNA，經驗證無此基因多態性的DNA)和三個先經過直接測序法篩選驗證的冰凍組織樣本。 (左邊為本發明篩選結果，右邊為直接測序驗證結果)左邊結果(本發明肉眼可見的檢測結 果)從上至下依次為多態性陽性(質控，綠色）、多態性陰性(質控，黃色）、多態性陽性(樣本， 綠色）、多態性陽性(樣本，綠色）、多態性陽性(樣本，綠色）、多態性陰性(樣本，黃色）、多態 性陰性(樣本，黃色）；直接測序結果從上至下依次為陽性對照；陰性對照;樣本2測序結果： TGGCC^GCCCA;樣本3測序結果:TGCC^GCCCA;樣本4測序結果:TGGCC^GCCCA;樣本5測序結果： TGGCCAGCCCA;樣本6測序結果:TGGCCAGCCCA(劃線字母為多態性的堿基序列，此為雜合多態 性)。
[0041 ]圖5.篩選EGFRL858R引物時無預先使PNA與樣本DNA結合情況下，顯示的引物序列、 ARPS結果和瓊脂糖凝膠電泳數據。A:以篩選EGFR L858R的另一個錯配堿基在反向引物中的 位置（淡色字母并且下有黑框標記）』，瓊脂糖凝膠電泳和ARPS的結果。目的片段長度為 20lbp的"+"表示從RPA反應試劑盒（143bp)的陽性對照。所使用的DNA量為300ng。圖中顯示 無論再多加任何的錯配堿基T、A、G，都會產生假陽性結果，即陽性細胞系和陰性細胞系均為 綠色，而陰性質控品(無 DNA)為黃色，則結果可靠。 圖1: EGFR19號染色體引物的特異性。 圖2:篩選EGFRL858R點多態性中設計的引物的特異性。 圖3A: 19號染色體缺失多態性的靈敏度 圖3B:檢測L858R多態性的靈敏度 圖4A:顯示檢測篩選的臨床樣本中EGFR19Del(2)型多態性的情況。 圖4B:顯示篩選的臨床樣本中EGFRL858R多態性的情況。 圖5:顯示引物序列和瓊脂糖凝膠電泳數據。A:篩選EGFR L858R的另一個錯配堿基在反 向引物中的位置(綠色字母）』:瓊脂糖凝膠電泳和ARPS的結果。
【具體實施方式】
[0042]下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細說明，但本發明并不局限于具體實施 例。
[0043] 人類非小細胞肺癌細胞株NCI-H1975，HCC-827和A-549得自美國模式菌種收集中 心(ATCC，Manassas，VA，USA)獲得，并保持在RPMI-1640培養基(Gibco，美國），并用10%胎牛 血清(HyClone公司，美國），100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素，在37°C在含有5% C02和95% 空氣的潮濕培養箱中。其NCI-H1975細胞含有所述EGFR21號外顯子L858R的單個核苷酸多態 性，HCC-827細胞含有所述EGFR19號外顯子15個堿基的缺失，和A-549細胞含有野生型EGFR 目標DNA序列。
[0044] 實施例1
[0045] 篩選15個堿基缺失的EGFR19De 1 (2)多態性的具體過程為：
[0046]在篩選目的基因片段多態性之前，先根據缺失堿基位置尋找一對合適(考慮特異 性和敏感性)的引物，即利用NCBI網站中的BLAST工具（http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/ Blast, cgi)，檢查引物的理論特異性。利用含有此多態性的細胞系HCC827和未含有此多態 性的細胞系A549進行擴增篩選并且利用瓊脂糖凝膠電泳再次確定篩選引物的特異性和敏 感性。
[0047] 此探究過程中試劑及樣本加入量及順序:將12yL雙蒸水、2yL正向引物、2yL反向引 物（引物濃度均為1〇μΜ)、2μL樣本DNA(濃度為150ng/yL)和29.5yL重泡脹緩沖液 (rehydration buffer)加入到含有凍干擴增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的EP管中，混勾后 再向其中加入2.5yL醋酸鎂溶液(280mM)混勻、擴增。最合適的擴增時間為15min，再加入濃 度為200X的SYBR GreenI (Solarbio，北京，索萊寶科技有限公司），每20yL產物應用lyL。以 上均考慮到敏感性和特異性的平衡。
[0048]
[0049]為了檢測篩選EGFR19Del(2)多態性中設計的引物的特異性，按照上述方法，分別 對下述樣品進行檢測：1.以TwistDX擴增試劑盒(TwistDX，Cambridge，UK)中的自帶陽性細 菌DNA片段，擴增后電泳條帶長度為143bp為本實驗陽性對照組、2.以無樣本DNA為陰性對 照組、19號染色體缺失陽性細胞系HCC827和陰性細胞系A549兩兩一組，分為擴增