時間不同 的4組，挑選出設計的8組引物中特異性最好的引物組（以沒有二聚體的單一條目的帶為引 物篩選理由）檢測結果如圖1所示：
[0050]圖1表示EGFR19號染色體引物的特異性。從左至右依次顯示了陽性對照組（細菌 DNA，143bp目的片段）、陰性對照組(無樣本DNA)、20minl9號染色體缺失陽性細胞系(HCC827 細胞系，266bp)和陰性細胞系(A549細胞系）、15minl9號染色體缺失陽性細胞系(HCC827細 胞系，266bp)和陰性細胞系(A549細胞系）、10minl9號染色體缺失陽性細胞系(HCC827細胞 系，266bp)和陰性細胞系(A549細胞系)和5minl9號染色體缺失陽性細胞系(HCC827細胞系， 266bp)和陰性細胞系(A549細胞系）。5~20min都能夠特異性的擴增到目的片段，即EGFR19 號染色體引物的擴增時間至少為5min，而考慮到雜質等因素，最優的擴增時間為15min。 [0051 ] 實施例2
[0052] 本發明在篩選單個核苷酸多態性EGFRL858R的具體過程為：
[0053]在篩選目的基因片段多態性之前，先根據缺失堿基位置尋找一對合適(考慮特異 性和敏感性)的引物，即利用NCBI網站中的BLAST工具（http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/ Blast, cgi )，檢查引物的理論特異性，還利用了網站 http:// www6 · appliedbiosystems · com/support/pnadesigner · cfm.篩選了 PNA退火溫度Tm值為66 °C )。利用含有此多態性的細胞系H-1975和未含有此多態性的細胞系A549進行擴增篩選并 且利用瓊脂糖凝膠電泳再次篩選引物的特異性和敏感性。
[0054] 此探究過程中試劑及樣本加入量及順序:將1 OyL雙蒸水、2yLPNA、2yL樣本DNA (濃 度為150ng/yL)，預先進行99°C解鏈2min，66°CPNA-DNA結合2min，再加入2yL正向引物、2yL 反向引物（引物濃度均為1 ΟμΜ)、和29.5yL重泡脹緩沖液(rehydration buf f er)加入到含有 凍干擴增酶（TwistDX，Cambridge，UK)的EP管中，混勻后再向其中加入2.5yL醋酸鎂溶液 (280mM)混勻、擴增，合適的擴增時間為15min。再加入濃度為200X的SYBR GreenI (Solarbio,北京，索萊寶科技有限公司，每20yL產物應用lyL)，以上均考慮到敏感性和特異 性的平衡。顯示結果。
[0055]
[0056]
[0057]為了檢測篩選EGFRL858R點多態性中設計的引物的特異性，按照上述方法，分別對 下述樣品進行檢測：1.以TwistDX擴增試劑盒(TwistDX，Cambridge，UK)中的陽性對照(細菌 DNA，143bp)為本實驗的陽性對照組、2.以無樣本DNA為陰性對照組、L858R基因多態性陽性 細胞系H1975細胞系為檢測對象，未含有此點多態性的A549細胞系為陰性檢測對象，兩兩一 組，分為擴增時間不同的4組，設計的10組引物中特異性最好的引物組（以沒有二聚體的單 一目的條帶為引物篩選理由）檢測結果如圖2所示：
[0058]圖2表示篩選EGFRL858R點多態性中設計的引物的特異性。從左至右依次顯示了陽 性對照組（細菌DNA，143bp目的片段）、陰性對照組(無樣本DNA)、10minL858R陽性細胞系 (H1975細胞系，目的片段長201bp)和陰性細胞系（A549細胞系）、15minL858R陽性細胞系 (H1975細胞系，201bp)和陰性細胞系(A549細胞系）、20minL858R陽性細胞系(H1975細胞系， 201bp)和陰性細胞系(A549細胞系）和5minL858R陽性細胞系(H1975細胞系，201bp)和陰性 細胞系(A549細胞系）<a〇min-20min都特異性的擴增了目的片段。5min時間不適用于此篩 選。即EGFRL858R點多態性中設計的引物的擴增時間至少為lOmin，而考慮到雜質等因素，最 優的擴增時間為15min。
[0059] 實施例3
[0060]篩選本發明(ARPS)的敏感度的具體實施過程為：
[00611 1.將含有多態性的細胞系DNA和非多態性細胞系DNA混合，分別將多態性細胞系 DNA(總 DNA 含量為 300ng)分別稀釋為濃度為 100%、80%、60%、40%、30%、20%、10%和 0%。（ 100 %即300ng的DNA全部為多態性細胞系DNA，80%即300ng的DNA中有240ng為多態性 細胞系DNA，60ng為非多態性細胞系DNA，以此類推）
[0062] 2 .按照實施例1所述方法，分別對下述樣品進行檢測：除了試劑盒中的陽性對照 (+ )和無 DNA的陰性對照（-)，還將多態性細胞系DNA(HCC-827)和正常目的基因片段細胞系 DNA(A-549細胞系）混合，多態性細胞系DNA(HCC-827)分別占 100%、80%、60%、40%、30%、 20 %、10%和0%。圖示3A顯示HCC-827細胞系DNA占 100%、80%、60%、40%和30% 時，均可 產生肉眼可見的綠色熒光，瓊脂糖凝膠電泳結果也證實了這一點（單一目的條帶的產生）。 結果說明檢測19號染色體缺失多態性的靈敏度為30% ;
[0063] 按照實施例2所述方法，分別對下述樣品進行檢測：除了試劑盒中的陽性對照(+ ) 和無 DNA的陰性對照（-)，還將多態性細胞系DNA(H-1975)和正常目的基因片段細胞系DNA (A-549)混合，多態性細胞系 DNA(H-1975)分別占 100%、80%、60%、40%、30%、20%、10% 和0%。圖示3B顯示H-1975細胞系DNA占100%、80%、60%、和40%時，均可產生肉眼可見的 綠色熒光，瓊脂糖凝膠電泳結果也證實了這一點（單條帶產生）。結果說明檢測L858R多態性 的靈敏度為40 %;
[0064] 分別反應后發現在EGFR19Del多態性中的敏感度為30%(多態性DNA含量，如圖 3A)，即，在EGFR19Del多態性中的敏感度為待檢樣本中目的DNA片段的量至少為gOngiGFR L858R多態性中的敏感度為40%(多態性DNA含量，如圖3B)。即，在EGFR L858R多態性中的敏 感度為待檢樣本中目的DNA片段的量至少為120ng。
[0065] 實施例4
[0066] 篩選的冰凍組織樣本中EGFR19Del (2)型多態性的情況
[0067]本發明收集的手術切除樣本來自大連醫科大學附屬第二醫院(大連，中國）在2015 年接受病理治療的患者(均根據對肺癌的分期方案確診的46例肺癌患者）。該研究通過了大 連醫科大學附屬第二醫院審核，每個參與這項研究的病人均簽署過了書面知情同意書。這 一組患者包括25名女性和21例男性，從42至87歲（中位數66歲）。手術切除后，所有的切除組 織立刻快速冷凍并儲存在_80°C直至使用。
[0068]為了進一步評估EGFR突變多態性的非小細胞肺癌組織標本，本發明收集的46例非 小細胞肺癌患者手術切除組織樣本，在我院采用突變多態性特異性擴增系統(ARMS)篩選出 三例為表皮生長因子受體L858R多態性和一例EGFR19號染色體缺失的基因多態性樣本，本 發明利用測序法再次確認了這四個突變多態性樣本和兩個非突變多態性標本中的目標靶 DNA序列，然后利用本發明進行篩查(圖4)。
[0069]本發明利用細胞系HCC-827和A549分別作為陽性和陰性對照（質控），白色背景為 篩選環境，篩選臨床冰凍標本的基因多態性情況。然后，本發明使用ARPS新方法篩選了這六 個組織樣品中EGFR相關序列多態性(如實施例1)，并發現15min擴增后，混合預先滴加在EP 管帽上的SYBR即出現可視化的結果（圖4A)，并與DNA測序結果一致。
[0070]具體步驟為：將上述實施例1中驗證成功的HCC-827細胞系DNA作為陽性對照，A-549細胞系DNA做為陰性對照，新鮮冰凍樣本I、5、6(casel、case5、case6)為篩查對象，將12μ L雙蒸水、2yL正向引物、2yL反向引物（引物濃度均為1 ΟμΜ)、2yL樣本DNA(濃度為150ng/yL) 和29.5yL重泡脹緩沖液（rehydration buf fer)加入到含有凍干擴增酶（Twi stDX， Cambridge，UK)的EP管中，混勻后再向其中加入2.5yL醋酸鎂溶液（280mM)混勻、擴增。擴增 15min后，將預先滴在EP管蓋內的2.5yL的SYBR混勻(每20yL產物加入lyLSYBR)，觀察結果。 [0071] ARPS結果顯示新鮮冰凍樣本l(casel)產生肉眼可見的綠色熒光，并與PCR擴增后 測序法結果相一致(多態性陽性）；樣本5和6沒有產生肉眼可見的綠色熒光;新鮮冰凍樣本 經PCR擴增后測序結果也為多態性陰性。
[0072] 篩選的臨床樣本中EGFR L858R多態性的情況
[0073]本發明利用細胞系H-1975和A549分別作為陽性和陰性對照（質控），白色背景為篩 選環境，篩選臨床冰凍標本的基因多態性情況。本發明（ARPS)篩選了這六個組織樣品中 EGFR相關序列多態性，并發現15min擴增后，混合預先滴加在EP管帽上的SYBR即出現可視化 的結果（圖4B)，并與DNA測序結果一致。
[0074]具體步驟為:將上述實施例2中驗證成功的H-1975細胞系DNA作為陽性對照，A-549 細胞系〇嫩做為陰性對照，新鮮冰凍樣本2、3、4、5、6(〇3862、〇380 3、〇3864、〇3865、〇3866)為 篩查對象，將10yL雙蒸水、2yLPNA、2yL樣本DNA(濃度為150ngAiL)，預先