進行99°C解鏈2min， 66°CPNA-DNA結合2min，再加入2yL正向引物、2yL反向引物（引物濃度均為ΙΟμΜ)、和29.5yL 重泡脹緩沖液(rehydration buffer)加入到含有凍干擴增酶(TwistDX,Cambridge，UK)的 EP管中，混勻后再向其中加入2.5yL醋酸鎂溶液(280mM)混勻、擴增，擴增15min后，將預先滴 在EP管蓋內的2.5yL的SYBR混勻(每20yL產物加入lyLSYBR)，觀察結果。
[0075] ARPS結果顯示新鮮冰凍樣本2(CaSe2)、3(CaSe3)、4( CaSe4)產生肉眼可見的綠色 熒光，并與PCR擴增后測序法結果相一致(多態性陽性）；樣本5和6沒有產生肉眼可見的綠色 熒光，新鮮冰凍樣本經PCR擴增后測序結果也為多態性陰性。
[0076]圖4A:顯示檢測篩選的臨床樣本中EGFR19Del(2)型多態性的情況。從上至下依次 陽性質控(HCC827細胞系DNA)、陰性質控(A549細胞系DNA)、一個陽性臨床樣本中（經過直接 測序法檢測篩選驗證過的19Del (2)多態性樣本）、兩個癌旁組織（經過測序法篩選了非 19Del多態性）。（左邊為本發明檢測篩選結果，右邊為直接測序驗證結果）
[0077]圖4B:B:顯示篩選的臨床樣本中EGFRL858R多態性的情況。從上至下依次為陽性質 控(H1975細胞系DNA)、陰性質控(A549細胞系DNA)、三個陽性臨床樣本(經過直接測序法篩 選驗證過的L858R多態性）、兩個癌旁組織(經過測序法篩選了非L858R多態性)樣本。（左邊 為本發明篩選結果，右邊為直接測序驗證結果）
[0078] 實施例5
[0079] 篩選點多態性時，未預先經過PNA與非目的條帶結合（即99°C2min和66°C2min)的 篩選效果
[0080]為了驗證是否有必要先使PNA與非目的序列結合，本發明在篩選EGFRL858R點多態 性時也驗證了同時將10yL雙蒸水、2yL的PNA、2yL正向引物、2yL反向引物、2yL樣本DNA和 29.5yL重泡脹緩沖液(rehydration buffer)加入到含有凍干擴增酶(TwistDX，Cambridge， UK)的無核酸及核酸酶的EP管中，混勻后再向其中加入2.5yL醋酸鎂溶液（280mM)混勻、擴 增。擴增15min后，濃度為200X的SYBR GreenI(S〇larbi〇,北京，索萊寶科技有限公司）溶液 每20yL產物應用lyL，樣本DNA的量為300ng(以上考慮到敏感性和特異性的平衡）。雖然又加 入了靶序列EGFR L858R的另一個錯配堿基（圖5,綠色字母）。瓊脂糖凝膠電泳和ARPS的結果 也不甚理想。（即篩選點多態性時，必須先利用PNA與非目的序列結合，去除假陽性，圖5)。
[0081] 圖5.顯示引物序列和瓊脂糖凝膠電泳數據。A:篩選EGFR L858R的另一個錯配堿基 在反向引物中的位置（綠色字母）』：瓊脂糖凝膠電泳和ARPS的結果。目的片段長°C為 201bp，"+"表示從RPA反應試劑盒（143bp)的陽性對照。所使用的DNA量為300ng。
[0082] 以上內容是結合優選的技術方案對本發明所做的進一步詳細說明，不能認定發明 的具體實施僅限于這些說明。對本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發 明的構思的前提下，還可以做出簡單的推演及替換，都應當視為本發明的保護范圍。 序列表 < 110> -種篩選人類EGFR基因多態性的引物組、試劑盒及其檢測方法 <120>大連醫科大學附屬第二醫院 2015 <160> 5 <I70> Patentlti version <?. 10> 1 <211> 39 <212> DNA <213> ?Η向引物
[0083] <400> 1 gtgagaaagl laaaauccc glcgcialca agacalctc 3:9 <210> 2 <21 卜 36 <212> DMA <213>反向引物 <棚> 2 galaccagca igggagaggc caglgclgic tclaag 36 <210> 3 <211^ 31 212> DNA
[0084] <213? 正向引物 <400> 3 clgaallcgg algcagagcl tcUccxatg a 31 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213?反向引物 <400> 4 cUtclcUc cgcaccxagc agtllggcxc 30 <210 5 <211> 10 <212> DMA M FNA <400> 5 gccagcccaa 10
【主權項】
1. 一種篩選人類EGFR基因多態性的引物組，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1~2或者SEQ ID NO.3~5所示。2. -種篩選人類EGFR基因多態性的試劑盒，其特征在于:包括權利要求1所述的引物組 以及檢測試劑：核苷酸序列為SEQ ID NO. 1~2和/或者SEQ ID NO.3~5所示的引物，重泡脹 緩沖液、醋酸鎂溶液、SYBR Green I溶液及含有凍干擴增酶的EP管。3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：還包括記載檢測待測樣品方法的說明 書： 將12yL雙蒸水、2yL的濃度為ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的濃度為ΙΟμΜ的反向引 物SEQ ID N0.2、2yL的濃度為150ngAiL的樣本DNA和29.5yL重泡脹緩沖液加入到含有凍干 擴增酶的E P管中，混勻后再向其中加入2.5 μ L濃度為2 8 0mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少 5min，再按照每20yL產物應用lyL的比例，加入濃度為200X的SYBR Green 1〇4. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：還包括記載檢測待測樣品方法的說明 書： 將10yL雙蒸水、2yL的濃度為20μΜ的PNA SEQ ID N0.5、2yU^度為150ng/yL的樣本DNA， 預先進行99°C解鏈2min，66°C結合2min，再加入2yL的濃度為ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.3、 2yL的濃度為ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO.4,和29.5yL重泡脹緩沖液加入到含有凍干擴增酶 的EP管中，混勻后再向其中加入2.5yL濃度為280mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少lOmin，再 按照每20yL產物應用lyL的比例，加入濃度為200X的SYBR Green I。5. 根據權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于:所述說明書中還包括:取擴增產物30 yL加入100yL無水乙醇后，12000rpm/min離心5min，去除液體后再加入30yL雙蒸水，最后進 行瓊脂糖凝膠電泳檢測。6. 利用權利要求1所述的引物組的篩選人類EGFR基因多態性的方法，其特征在于:操作 步驟包括： 將12yL雙蒸水、2yL的濃度為ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.1、2yL的濃度為ΙΟμΜ的反向引 物SEQ ID N0.2、2yL的濃度為150ngAiL的樣本DNA和29.5yL重泡脹緩沖液加入到含有凍干 擴增酶的E P管中，混勻后再向其中加入2.5 μ L濃度為2 8 0mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少 5min，再按照每20yL產物應用lyL的比例，加入濃度為200X的SYBR Green 1〇7. 利用權利要求1所述的引物組的篩選人類EGFR基因多態性的方法，其特征在于:操作 步驟包括： 將10yL雙蒸水、2yL的濃度為20μΜ的PNA SEQ ID N0.5、2yU^度為150ng/yL的樣本DNA， 預先進行99°C解鏈2min，66°C結合2min，再加入2yL的濃度為ΙΟμΜ的正向引物SEQ ID N0.3、 2yL的濃度為ΙΟμΜ的反向引物SEQ ID NO.4,和29.5yL重泡脹緩沖液加入到含有凍干擴增酶 的EP管中，混勻后再向其中加入2.5以1^濃度為280mM的醋酸鎂溶液混勻、擴增至少lOmin后獲 得擴增產物，再按照每20yL擴增產物應用lyL的比例，加入濃度為200X的SYBR Green I。8. 根據權利要求6或7所述的檢測方法，其特征在于:操作步驟還包括，取擴增產物30yL 加入100yL無水乙醇后，12000rpm/min離心5min，去除液體后再加入30yL雙蒸水，最后進行 瓊脂糖凝膠電泳檢測。9. 權利要求1所述的引物組在制備篩選人類EGFR基因多態性的檢測試劑中的應用。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體組合運用了等位基因特異性擴增、重組酶聚合酶擴增、肽核酸結合DNA和SYBR？GreenⅠ顯色四種分子生物學方法。以肺癌EGFR基因多態性為篩選對象，進行基因多態性篩選方法的研究。獲得了一種篩選人類EGFR基因多態性的引物組、試劑盒及其檢測方法；引物序列如SEQ？ID？NO.1～5。可用于對EGFR多態性的篩選和對適合于靶向治療的患者的鑒別。本發明所述方法不需要任何大型設備，或側流篩選試紙的精密試劑、在特異性、敏感性、簡便性和即時篩選等方面都具有很大優勢，預計這種方法將是未來篩選基因多態性、與基因篩查發展愿望相一致的可靠的且具有低成本效益的快速篩選方法。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105648057
【申請號】
【發明人】王琪, 呂建新, 杜小慧, 劉元斌, 李恩成, 郭哲, 趙輝, 于若飛, 鄺言斌
【申請人】大連醫科大學附屬第二醫院
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月26日