一種煙草根結線蟲病的生物防治方法及其生防制劑的制作方法
【技術領域】
:
[0001]本發明屬于煙草病害防治領域，具體涉及一種煙草根結線蟲病的生物防治方法及其生防制劑。
技術背景:
[0002]煙草根結線蟲病是由根結線蟲侵入煙株根部而引起的。此線蟲屬線形動物門，線蟲綱、墊刃目，墊刃總科、異皮科，根結線蟲屬。我國以南方根結線蟲(Meloidogyneincongnita Chitwood)為害為主。
[0003]煙草根結線蟲病在苗期和大田期均可發生，多在大田成株期發病。染病煙株首先是根部形成大小不等的根瘤，須根上初生根瘤為白色。嚴重時整個根系腫脹變粗呈雞爪狀，病根后期中空腐爛，僅存留根皮和木質部，其中包含大量不同發育時期的病原線蟲。病株葉片從葉尖和邊緣開始干枯內卷，葉色變淡，生長不良似缺肥狀。須根上長出形狀、大小不等的根瘤，主根、駐叉根粗腫呈雞爪狀。高溫干旱癥狀明顯，重病株葉片發黃下垂甚至枯死。
[0004]煙草根結線蟲病在云南各煙區均有為害，上世紀90年代末“雙控”以前，因輪作困難等因素，發病面積較大，“雙控”后煙草種植面積減少，發病面積在減少。近年來發生面積有增加的趨勢，已成為為害煙草生產的主要病害之一。根結線蟲除直接為害煙株外，還會因線蟲在煙株根部造成傷口而誘發其他根莖部病害發生，如煙草黑脛病、根黑腐病、青枯病等，使為害加重。
[0005]目前，煙草根結線蟲病的防治主要依靠化學農藥、抗病品種和農業防治措施。化學農藥防治往往造成環境污染并降低煙草品質和食用安全性;抗病品種選育難度大、成本高，且大多只能抗根結線蟲病單個生理小種，在其他生理小種入侵時存在大面積爆發的危險；農業防治措施費工費時，防治效果普遍不理想。生物防治方法不僅能夠有效防治煙草根結線蟲病，還能有效保護生態環境，提高煙草品質和食用安全性。開發煙草根結線蟲病生物防治方法前景廣闊，對煙農和煙草種植產業良性發展具有重要意義。
【發明內容】
:
[0006]本發明的目的在于提供一種煙草根結線蟲病的生物防治方法及其生防制劑。
[0007]本發明的煙草根結線蟲病的生物防治方法包括:煙草育苗時根結線蟲拮抗菌定殖、煙苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌定殖、煙草植株生長期根結線蟲拮抗菌定殖，具體為:
[0008]A:煙草育苗時根結線蟲拮抗菌定殖:在煙草育苗時將根結線蟲拮抗復合微生物菌劑拌入市購的漂浮育苗基質中進行育苗，煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑拌入育苗基質的量為每10kg基質中加入0.5-5kg;或者在煙草出苗后按每畝0.2-1.0kg噴施根結線蟲拮抗菌劑200-1000倍稀釋液，每隔7-10天噴施I次，噴2-3次。
[0009]B:煙苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌定殖:在煙苗大田移栽前塘施煙草根結線蟲拮抗生物有機肥或移栽后灌施煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑;煙草根結線蟲拮抗生物有機肥在煙草移栽前按每畝20-100kg施入塘內；煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑按每畝2-1kg在煙苗移栽后稀釋200-1000倍液灌施。
[0010]C:煙草大田生長期根結線蟲拮抗菌定殖:在煙草大田生長期追施煙草根結線蟲拮抗生物有機肥和/或煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑;煙草根結線蟲拮抗生物有機肥在煙株周圍開塘穴施，每畝20-100kg，團棵期和旺長期按每畝20-100kg各追施I次煙草根結線蟲拮抗生物有機肥;或者將煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑按每畝2-10kg稀釋200-1000倍后灌施煙草根部，團棵期和旺長期按每畝2-10kg稀釋200-1000倍后各追施I次煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑。
[0011 ]上述A步驟所述的煙草育苗時根結線蟲拮抗菌的兩種定殖方式能單獨采用一種，亦能兩種同時米用；
[0012]上述B步驟所述的煙苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌的定殖，能單獨采用煙草根結線蟲拮抗生物有機肥或煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑進行定殖，亦能兩者同時采用進行定殖；
[0013]上述C步驟所述的煙草大田生長期根結線蟲措抗菌定殖，能單獨追施含煙草根結線蟲拮抗菌劑的生物有機肥或煙草根結線蟲拮抗菌劑，亦能兩者同時追施。
[0014]所述的煙草根結線蟲的生物防治方法，在煙草苗育苗時根結線蟲拮抗菌定殖、煙苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌定殖、煙草植株生長期根結線蟲拮抗菌定殖三個過程能單獨采用其中一部分措施，亦能全部措施一同采用。
[0015]用于本發明的煙草根結線蟲病的生物防治方法中的生防制劑包括:煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑和煙草根結線蟲拮抗生物有機肥;該生防制劑經由如下步驟得到:
[0016]—、分別將保藏在北京市海淀區中關村北一條13號、中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.1213、保藏日為2004年8月30日的巨大芽孢桿菌(BaciIIus megaterium)Ap25株;保藏號為CGMCC N0.1211、保藏日為2004年8月30日的褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)YKT41 株;保藏號為CGMCC N0.1212、保藏日為2004 年8月30日的越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)P418株；以及保藏在北京市朝陽區北辰西路I號院3號、中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.5938、保藏日為2012年3月27日的綠色木霉(Trichoderma viride)L_10株;保藏號為CGMCC N0.7938、保藏日 2013年7月 19 日為的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Tll-ff株五種菌種分別按常規方法進行液體或固體發酵;具體如下:
[0017]1、巨大芽孢桿菌Ap25的液體發酵
[0018]巨大芽孢桿菌Ap25的液體發酵按以下步驟進行:
[0019](I)斜面菌種:采用固體無氮培養基(K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.2g、NaCl
0.02g、CaC12 0.2g、Fe_EDTA 0.066g、Na2Mo04 0.002g、L_谷氨酸(或味精)0.05g、葡萄糖5g、瓊脂15g、pH7.2-7.4)將菌種接種在試管培養基中，28-32°C培養18-24小時。
[0020](2)搖瓶菌種:稱取蛋白胨1g、酵母浸出物Ig、氯化鈣0.2g配制成pH7.0的液體培養基，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養基中置搖床上28-32Γ培養18-24小時。
[0021](3)液體發酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂
0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質量百分比添加)、pH7.2-7.4培養基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養的菌種接種到發酵罐內(接種量為2-10% )，28-32°C條件下培養，每分鐘通發酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養時間36-48小時。在接種量為10%，30°C恒溫培養的情況下，32小時進入穩定期，此時可結束發酵，獲得巨大芽孢桿菌Ap25的孢子發酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0022]2、褐球固氮菌YKT41的液體發酵
[0023]褐球固氮菌YKT41的液體發酵按以下步驟進行:
[0024](I)斜面菌種:采用固體無氮培養基(K2HP04 0.64g,KH2PO4 0.16g,MgS04.7H200.2g、NaCl 0.2g、CaS04.2H20 0.05g^Na2MoO4 O-OOlg^FeSO4 0.03g、蔗糖20g、瓊脂 15g、水
1000ml、pH7.0-7.2)，將菌種接種在試管培養基中，28-32 °C培養18-24小時。
[0025](2)搖瓶菌種:采用液體無氮培養基(K2HP04 0.64g,KH2PO4 0.16g,MgS04.7H200.2g、NaCl 0.2g、CaS04.2H20 0.05g^Na2MoO4 O-OOlg^FeSO4 0.03g、蔗糖20g、水 1000ml、pH7.0-7.2)，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養基中置搖床上28-32°C培養18-24小時。
[0026](3)液體發酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂
0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質量百分比添加)，pH7.0-7.2的培養基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養的菌種接種到發酵罐內(接種量為2-10%)，28-32 0C條件下培養，每分鐘通發酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養時間36-48小時。在接種量為10 %，300C恒溫培養的情況下，32小時進入穩定期，此時作為發酵終點，獲得褐球固氮菌YKT41的孢子發酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0027]3、越南伯克霍爾德氏菌P418的液體發酵
[0028]越南伯克霍爾德氏菌P418的液體發酵按以下步驟進行:
[0029](I)斜面菌種:采用固體無氮培養基(K2HP04 0.5g、MgS04.7H20 0.2g、NaCl 0.02g、CaCl2 0.2g、Fe-EDTA 0.066g,Na2MoO4 0.002g、L_谷