一種番茄根結線蟲病的生物防治方法及其生防制劑的制作方法
【技術領域】
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[0001]本發明屬于番茄病害防治領域，具體涉及一種番茄根結線蟲病的生物防治方法及其生防制劑。
【背景技術】
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[0002]番茄根結線蟲病是近年來危害以番茄為主的蔬菜的一種重要根部病害，主要由南方根結線蟲(Meloidogyne incongnita Chitwood)侵染所致。該病主要發生在須根和側根上。病部腫大成不規則形瘤狀結。剖開根結有乳白色或淡黃色雌蟲體。根結大小不一，一串串如糖糊蘆一般。染病植株發育不良、葉片黃化、瘦弱矮小，生長不良，結果少而小，產量低，果實品質差。干旱時，得病植株易萎蔫，直至整枝枯死，損失嚴重。該病在溫室、大棚和露地等番茄植株上都有發生，特別是在溫室條件下四季連續發病，其毀苗重植事件經常發生。因此，這種病害已成為番前生產中的嚴重障礙之一。該病除了能危害番前外，還能危害前子、黃瓜、萵苣、菜豆、芹菜、辣椒、甘藍、大白菜等30多種蔬菜。
[0003]根結線蟲以2齡幼蟲或卵隨病殘體在土壤中越冬；線蟲在病株根部生存繁殖并靠病土、病苗及灌溉水等傳播。條件適宜時，2齡幼蟲接觸番茄根部后大多從根尖部侵入，定居在根塊生長錐內。最后，線蟲在病體內取食、生長發育，并能分泌出刺激物質，使植株根部細胞劇烈增生形成根結。根結線蟲大多分布在30cm深的土層內，其中以5?30cm深度內的耕作層土壤中根結線蟲群體數量最多。一般地勢高燥、土質疏松，濕度適當，鹽份低的地塊最適于線蟲存活。
[0004]目前，番茄根結線蟲病的防治主要依靠化學農藥和農業防治措施。化學農藥防治往往造成環境污染并降低番茄品質和食用安全性;農業防治措施費工費時，防治效果普遍不理想。生物防治方法不僅能夠有效防治番茄根結線蟲病，還能有效保護生態環境，提高番茄品質和食用安全性。開發番茄根結線蟲病生物防治方法前景廣闊，對番茄種植農戶和番茄種植產業良性發展具有重要意義。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的在于提供一種番茄根結線蟲病的生物防治方法及其生防制劑。
[0006]本發明的番茄根結線蟲病的生物防治方法包括:番茄育苗時根結線蟲拮抗菌定殖、番茄苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌定殖、番茄大田生長期根結線蟲拮抗菌定殖，具體為:
[0007]A.番茄育苗時根結線蟲拮抗菌定殖:在番茄育苗時將根結線蟲拮抗菌劑拌入育苗基質進行育苗，或者在番茄出苗后噴施根結線蟲拮抗菌劑200?1000倍稀釋液，每隔7?10天噴施一次，噴2?3次;番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑拌入育苗基質的量為每10kg基質中加入0.5?5kg;
[0008]B.番茄苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌定殖:在番茄苗大田移栽前塘施含番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑的生物有機肥或移栽時灌施番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑；含番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑的生物有機肥在移栽前的施用量按每株0.05?0.5kg施入塘內；番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑在番茄苗移栽時兌水稀釋200?1000倍，每株灌施0.5?5.0L稀釋液；
[0009]C.番茄植株生長期根結線蟲拮抗菌定殖:在番茄生長期施用含番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑的生物有機肥或番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑;含番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑的有機肥在番茄植株周圍開溝穴施，每株0.05?0.5kg，每個月施用一次，共2?4次;番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑稀釋200?1000倍，每株灌施0.5?5.0L稀釋液，每個月施用一次，共2?4次。
[0010]上述A步驟所述的番前育苗時根結線蟲措抗菌的兩種定殖方式能單獨采用一種，亦能兩種同時米用；
[0011]上述B步驟所述的番茄苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌的定殖，能單獨采用番茄根結線蟲拮抗生物有機肥或番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑進行定殖，亦能兩者同時采用進行定殖；
[0012]上述C步驟所述的番茄植株生長期根結線蟲拮抗菌定殖，能單獨追施含番茄根結線蟲拮抗菌劑的生物有機肥或番茄根結線蟲拮抗菌劑，亦能兩者同時追施；
[0013]所述的番茄根結線蟲的生物防治方法，在番茄苗育苗時根結線蟲拮抗菌定殖、番茄苗大田移栽時根結線蟲拮抗菌定殖、番茄植株生長期根結線蟲拮抗菌定殖三個過程能單獨采用其中一部分措施，亦能全部措施一同采用。
[0014]用于本發明的番茄根結線蟲病的生物防治方法中的生防制劑包括:番茄根結線蟲拮抗復合微生物菌劑和番茄根結線蟲拮抗生物有機肥;該生防制劑經由如下步驟得到:
[0015]—、將保藏在北京市海淀區中關村北一條13號、中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC N0.1211、保藏日為2004年8月30日的褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)YKT41 株，保藏號為CGMCC N0.1212、保藏日為2004年8月30 日的越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)P418株，保藏號為CGMCC N0.1498、保藏日為2005年10月20日的綠色木霉(Trichoderma viride)LTR_2株；以及保藏在北京市朝陽區北辰西路I號院3號、中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC N0.5938、保藏日為2012年3月27日的綠色木霉(Trichoderma viride)L_10株，保藏號為CGMCC N0.7938、保藏日為2013年7月 19 日的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)Tll-ff株;五種菌種分別按常規方法進行液體或固體發酵。具體如下:
[0016]1、褐球固氮菌YKT41的液體發酵
[0017]褐球固氮菌YKT41的液體發酵按以下步驟進行:
[0018](I)斜面菌種:采用固體無氮培養基(K2HP04 0.64g,KH2PO4 0.16g,MgS04.7H200.2g、NaCl 0.2g、CaS04.2H20 0.05g^Na2MoO4 O-OOlg^FeSO4 0.03g、蔗糖20g、瓊脂 15g、水1000ml、pH7.0-7.2)，將菌種接種在試管培養基中，28-32 °C培養18-24小時。
[0019](2)搖瓶菌種:采用液體無氮培養基(K2HP04 0.64g,KH2PO4 0.16g,MgS04.7H20
0.2g、NaCl 0.2g、CaS04.2H20 0.05g^Na2MoO4 O-OOlg^FeSO4 0.03g、蔗糖20g、水 1000ml、pH7.0-7.2)，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養基中置搖床上28-32°C培養18-24小時。
[0020](3)液體發酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質量百分比添加)、pH7.0-7.2培養基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養的菌種接種到發酵罐內(接種量為2-10% )，28-32°C條件下培養，每分鐘通發酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養時間36-48小時。在接種量為10%，30°C恒溫培養的情況下，32小時進入穩定期，此時可作為發酵終點，獲得褐球固氮菌YKT41的孢子發酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0021 ] 2、越南伯克霍爾德氏菌P418的液體發酵
[0022]越南伯克霍爾德氏菌P418的液體發酵按以下步驟進行:
[0023](I)斜面菌種:采用固體無氮培養基(K2HP04 0.5g,MgS04.7H20 0.2g、NaCl 0.02g,CaCl2 0.2g、Fe-EDTA 0.066g,Na2MoO4 0.002g、L_谷氨酸(或味精)0.05g、葡萄糖5g、瓊脂15g、pH7.2-7.4)將菌種接種在試管培養基中，28-32°C培養18_24小時。
[0024](2)搖瓶菌種:稱取蛋白胨1g、酵母浸出物Ig、氯化鈣0.2g配制成pH7.0的液體培養基，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養基中置搖床上28-32Γ培養18-24小時。
[0025](3)液體發酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂
0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質量百分比添加)、pH7.2-7.4培養基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養的菌種接種到發酵罐內(接種量為2-10% )，28-32°C條件下培養，每分鐘通發酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養時間36-48小時。在接種量為10%，30°C恒溫培養的情況下，32小時進入穩定期，此時可結束發酵，獲得越南伯克霍爾德氏菌P418的孢子發酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0026]3、綠色木霉LTR-2的固體發酵
[0027]綠色木霉LTR-2的固體發酵按以下步驟進行:
[0028](I)斜面菌種:采用固體TOA培養基，將菌種接種在試管培養基中，28-32°C培養48-72小時。
[0029](2)茄瓶菌種:采用液體PDA培養基，將試管菌種接種在液體茄瓶中，于搖床上28-32 °C振蕩培養72-96小時。
[0030](3)液體菌種:采用種子培養基