氨酸(或味精)0.05g、葡萄糖5g、瓊脂15g、pH7.2-7.4)將菌種接種在試管培養基中，28-32°C培養18_24小時。
[0030](2)搖瓶菌種:稱取蛋白胨1g、酵母浸出物Ig、氯化鈣0.2g配制成pH7.0的液體培養基，將斜面菌種的單菌落接種在液體無氮培養基中置搖床上28-32Γ培養18-24小時。
[0031](3)液體發酵:采用含蔗糖I %、玉米粉4%、黃豆餅粉I %、硫酸銨0.2%、硫酸鎂
0.02%、磷酸二氫鉀0.1 %、磷酸氫二鉀0.1 % (前述物料均按質量百分比添加)、pH7.2-7.4培養基，121°C滅菌20min，將搖瓶液體培養的菌種接種到發酵罐內(接種量為2-10% )，28-32°C條件下培養，每分鐘通發酵罐容積1-1.5倍的氣量，攪拌速度為150-250r/min，培養時間36-48小時。在接種量為10 %，300C恒溫培養的情況下，32小時進入穩定期，此時結束發酵，獲得越南伯克霍爾德氏菌P418的孢子發酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0032]4、綠色木霉L-1O的液體發酵
[0033]綠色木霉L-1O的液體發酵按以下步驟進行:
[0034](I)斜面菌種:采用固體PDA培養基，將工程菌株L-1O接種在試管內，28°C培養72-96小時；
[0035](2)茄瓶菌種:采用液體PDA培養基，將試管菌種接種在液體三角瓶中，置于搖床上28 °C振蕩培養24-48小時；
[0036](3)液體培養:采用發酵培養基(羧甲基纖維素鈉I %，玉米粉I %，葡萄糖0.5 %，豆餅粉2%，磷酸氫二鉀0.2%，磷酸二氫鉀0.2%，碳酸鈣0.5%，pH6.0)，121°C滅菌20min，將三角瓶種接種發酵罐，接種量0.2%, 28 0C培養，溶氧量40-50 %，通氣量1:0.6-0.8,攪拌速度為160r/min，培養30hr后，調整發酵參數:25°C培養，溶氧量20-30%，通氣量1:0.4-0.6,攪拌速度為120r/min，添加0.1 %的誘導劑甲醛，避光培養6_8小時，至厚垣孢子量達到2 X19個/ml以上時，結束發酵；即獲得所述綠色木霉L-1O的厚垣孢子發酵液，留作配制復合微生物菌劑用。
[0037]5、哈茨木霉Tl 1-W的固體發酵
[0038]哈茨木霉Tl1-W的固體發酵按以下步驟進行:
[0039](I)斜面菌種:采用固體PDA培養基，將哈茨木霉Tll-W菌種接種在試管培養基中，28 °C培養48-72小時。
[0040](2)茄瓶菌種:采用液體PDA培養基，將試管菌種接種在液體茄瓶中，于搖床上28°C振蕩培養72-96小時。
[0041](3)固體菌種:采用固體培養基，將麩皮4份、稻殼I份按體積比混合均勻，加入50-70 %的水，pH6.0，121 °C滅菌40min后冷卻，在混合接種器內將液體菌種與固體培養基混合均勻，接種量為5-10%，接種完畢轉移到固體培養室內培養。
[0042](4)培養:培養基厚度5cm，料溫控制在28-32°C，室溫控制在25-32°C，空氣濕度控制在95-100%，培養時間5-7天。
[0043](5)培養完畢將固體培養物自然風干，成品含水量控制在5-10%，得哈茨木霉Tll-W固體培養物，過100目篩收集孢子粉，留作配制復合微生物菌劑用。
[0044]二、將液體或固體發酵的巨大芽孢桿菌Ap25的孢子發酵液、褐球固氮菌YKT41的孢子發酵液、越南伯克霍爾德氏菌P418的孢子發酵液、綠色木霉L-1O的孢子發酵液及哈茨木霉Tll-W的孢子粉五種菌劑中的兩種或多種菌劑配制成復合制劑，即得到有效活菌數不低于2億/g的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑;具體如下:
[0045]a.煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑I:
[0046]由巨大芽孢桿菌Ap25孢子發酵液、褐球固氮菌YKT41孢子發酵液、越南伯克霍爾德氏菌P418孢子發酵液按體積比I?3:1?6:1?8配制得到。
[0047]b.煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑2:
[0048]由褐球固氮菌YKT41孢子發酵液、越南伯克霍爾德氏菌P418孢子發酵液、綠色木霉L-1O孢子發酵液按體積比I?7:1?7:1?6配制得到。
[0049]c.煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑3:
[0050]由綠色木霉L-1O孢子發酵液和哈茨木霉Tl1-W孢子粉按質量比I?5:1?9配制成可濕性粉劑。
[0051 ]三、以復合微生物菌劑為主要功能性成分，添加蛋白渣、褐煤、生化黃腐酸、生物炭、碳酸鈣配制得到有效活菌數不低于0.2億/g，N、P、K的總養分含量不低于5%，有機質含量不低于45%，蛋白質含量不低于20%的煙草根結線蟲拮抗生物有機肥;蛋白渣為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨任一種的發酵殘渣曬干后得到;具體如下:
[0052]a.煙草根結線蟲拮抗生物有機肥1:
[0053]由5?25%的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑I作為主要功能性成分，添加10?30%的蛋白渣、5?30%的褐煤、10?25%的生化黃腐酸、10?35%的生物炭，再按前述混合料添加0.5?2.5 %質量比的碳酸鈣配制得到；
[0054]b.煙草根結線蟲拮抗生物有機肥2:
[0055]由5?25%的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑2作為主要功能性成分，添加10?30%的蛋白渣、5?30%的褐煤、10?25%的生化黃腐酸、10?35%的生物炭，再按前述混合料添加0.5?2.5 %質量比的碳酸鈣配制得到；
[0056]c.煙草根結線蟲拮抗生物有機肥3:
[0057]由5?25%的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑3作為主要功能性成分，添加10?30%的蛋白渣、5?30%的褐煤、10?25%的生化黃腐酸、10?35%的生物炭，再按前述混合料添加0.5?2.5 %質量比的碳酸鈣配制得到；
[0058]d.上述比例均為質量百分比。
[0059]本發明的有益效果在于:生防制劑不僅能夠有效防治煙草根結線蟲病，還能有效保護生態環境，提高煙草品質和食用安全性;防治方法簡單易操作，成本低，對煙草根結線蟲防效高。
【具體實施方式】
:
[0060]下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0061]如下實施例的煙草根結線蟲病的生物防治方法的及其生防制劑同
【發明內容】
部分的描述。其中:
[0062]1、煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑由如下步驟得到:
[0063]a.煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑I:
[0064]由巨大芽孢桿菌Ap25孢子發酵液、褐球固氮菌YKT41孢子發酵液、越南伯克霍爾德氏菌P418孢子發酵液按體積比I或2或3:1或3或6:1或5或8配制得到。
[0065]b.煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑2:
[0066]由褐球固氮菌YKT41孢子發酵液、越南伯克霍爾德氏菌P418孢子發酵液、綠色木霉L-1O孢子發酵液按體積比I或3或7:1或4或7:1或3或6配制得到。
[0067]c.煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑3:
[0068]由綠色木霉L-1O孢子發酵液和哈茨木霉Tll-W孢子粉按質量比I或3或5:1或5或9配制成可濕性粉劑。
[0069]2、煙草根結線蟲拮抗生物有機肥由如下步驟得到:
[0070]a.煙草根結線蟲拮抗生物有機肥1:
[0071 ]由5 %或15 %或25 %的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑I為主要功能性成分，添加10%或20%或30%的蛋白渣、5%或15%或30%的褐煤、10%或15%或25%的生化黃腐酸、10 %或20 %或35 %的生物炭，再按前述混合料質量比添加0.5%或1.5%或2.5%的碳酸鈣配制得到；
[0072]b.煙草根結線蟲拮抗生物有機肥2:
[0073]由5%或15%或25%的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑2號作為主要功能性成分，添加10%或20%或30%的蛋白渣、5%或15%或30%的褐煤、10%或15%或25%的生化黃腐酸、10 %或20 %或35 %的生物炭，再按前述混合料質量比添加0.5%或1.5%或2.5%的碳酸鈣配制得到；
[0074]c.煙草根結線蟲拮抗生物有機肥3:
[0075]由5%或15%或25%的煙草根結線蟲拮抗復合微生物菌劑3號作為主要功能性成分，添加10%或20%或30%的蛋白渣、5%或15%或30%的褐煤、10%或15%或25%的生化黃腐酸、10 %或20 %或35 %的生物炭，再按前述混合料質量比添加0.5%或1.5%或2.5%的碳酸鈣配制得到；
[0076]上述步驟三中比例為質量百分比，蛋白渣為玉米漿、或棉籽餅粉、或花生餅粉、或酵母粉、或蛋白胨的發酵殘渣曬干后得到。
[0077]實施例1:
[0078]在煙苗出苗后，每隔7天或10天分別按每畝0.2kg或0.6kg或1.0kg噴施I次復合微生物菌劑I號、復合微生物菌劑2號和復合微生物菌劑3號200倍液或600倍液或1000倍液，共3次，未處理的煙苗作為對照，成苗后移栽到同一片往年根結線蟲病發病嚴重的田塊，按常規方法進行管理。煙葉采烤結束時調查煙株根系根結線蟲病發病情況，調查結果顯示:在煙苗出苗后分別噴施3次