一株中等嗜熱地衣芽孢桿菌及其在高溫含油污水處理中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于高溫采油污水處理領域的微生物新技術，設及一株產耐高溫脂肪酶中 等嗜熱地衣芽抱桿菌及其在高溫含油污水處理中的應用。
【背景技術】
[0002] 石油是我國最重要的能源之一，2014年我國石油產量高達2.1億噸，在生產、生活 中都發揮著十分重要的作用。然而石油開采過程中產生大量含石油控的高溫（約50°C)污 水，如不能得到有效處理，將會對環境和人類健康造成巨大危害。
[0003] 微生物法具有處理成本低、操作簡便、石油類污染物降解效果好、不易引起二次污 染等特點而在采油污水處理領域得到廣泛應用。浙江海洋學院選取油污處理廠長期受油污 污染的±壤進行富集化培養，篩選得到對柴油石油控具有分解作用的石油降解菌；中國海 洋大學開展高效石油降解菌的篩選及其在油田廢水深度處理中的應用，從石油污染的±壤 和水體中富集、分離到12株高效石油降解菌，各單菌株的降油率為40.3%~57.6%，其中Ξ 種菌可耐受40°C的溫度。沈陽大學從迂河油田和大慶油田污染±壤中分離出兩株高效石油 降解菌，分別為枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)和地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)。除油率分別為39%和48%。生長溫度分別為25~35°C和28~40°C。但傳統 方法中用到的微生物多為嗜中溫微生物，因此在處理高溫采油污水時需要采用冷卻塔先降 溫，然后再采用微生物處理。該方法存在能耗大、產生揮發性氣體污染的問題。
[0004] 近年來，嗜熱細菌引起了越來越多科學家的重視和興趣。國內北京大學郝瑞霞教 授早在2003年就開始降解石油控嗜熱細菌篩選。南開大學分子微生物學與技術教育部重點 實驗室也長期從事石油控降解菌包括嗜熱細菌的篩選及應用研究。南京農業大學沈標教授 長期從事燒控代謝和嗜熱細菌的相關研究，分離獲得MH-1等具有石油控降解能力的嗜熱細 菌，并對其alkB基因的相關特性進行了研究，運些前期研究為嗜熱細菌的驅油和污水處理 應用奠定了良好基礎。
[0005] 中國石油大學公開了嗜熱菌在處理稠油污水方法中的應用，（a)將嗜熱菌劑負載 于填料上；（b)將稠油污水W及負載于所述填料上的嗜熱菌劑共同置于反應單元中。查閱大 量文獻和專利書，發現未見耐熱地衣芽抱桿菌在高溫(45~60°C)含油廢水處理中的應用。
【發明內容】
[0006] (1)本發明提供一株能應用于處理采油污水和石油污染的中等嗜熱微生物菌株地 衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis) 〇
[0007] (2)本發明將所述的微生物菌株可高效處理高溫采油污水和石油污染，并具有產 生耐高溫脂肪酶的能力。
[000引本發明上述目的通過W下技術方案來實現：
[0009]本發明提供了一株中等嗜熱地衣芽抱桿菌，該菌是從中國石油化工集團公司華東 分公司泰州采油廠石油污染的±壤中W原油為唯一碳源的情況下55°C反復馴化獲得，命名 為 H43。
[0010] H43的細胞形態特征如下：在LB上培養2地的菌落直徑為4-5mm，菌落形態呈圓形， 邊緣整齊，表面濕潤光滑，淺黃色；油鏡下菌體呈短桿狀;生長溫度在40-60°C，最適生長溫 度50°C dpH為6~9，鹽度0~4%。菌體大小為(0.7~0.9皿）X (2.0~3.0皿），單個或短鏈排 列，端生鞭毛，中生芽抱，革蘭氏陽性菌。
[0011] 表1:地衣芽抱桿菌的生化特性
[0012]
[0013] 注：V'表示反應陽性表示反應陰性
[0014] 參照《Bergey's Mannual of Syetematic Bacteriology》的內容，根據形態特征、 生理生化特征和16sDNA分子鑒定，H43為地衣芽抱桿菌屬(Bacillus licheniformis)。
[001引本發明H43菌株對55°C含1 %原油的污水處理7d后石油控的降解率達到46% ;對泰 州油田^相分離器出水口取得的高溫含油污水（156mg/L石油控含量）處理效率高達 89.9%，同時產生脂肪酶。W上試驗表明地衣芽抱桿菌屬(Bacillus lichenifo;rmis)H43在 運用于高溫含油廢水的處理上效果明顯，且在處理污水的同時產多種具有重要應用價值的 生物工程產品。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43的原子力顯微鏡圖片 化43菌株原子力顯微鏡視圖）；
[0017] 圖2為本發明地衣芽抱桿菌的16s rDNA鑒定序列化43菌株經寶生物工程(大連)有 限公司測序獲得16s rDNA基因序列）；
[001引圖3為本發明地衣芽抱桿菌經NCBI BLAST之后得到的序列進化樹化43菌株經NCBI BLAST之后的系統進化樹）；
[0019] 圖4為本發明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43的抑、溫度、鹽度的生 長曲線化43菌株在不同溫度、pH和鹽濃度的生長變化）；
[0020] 圖5為本發明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油氣相色 譜圖，a為作用前，b為作用后化43菌株作用前后原油氣相色譜圖）；
[0021 ] 圖6為本發明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油中正燒 控碳數的分布情況化43菌株作用前后正構燒控組分含）；
[0022] 圖7為本發明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43對各正構燒控的降解 率化43菌株作用后不同正構燒控的降解率）；
[0023] 圖8為本發明地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis化43作用前后原油表面粘 度與剪切速率的變化情況化43菌株作用前后，原油粘度隨剪切速率的變化）；
【具體實施方式】
[0024] 實施例1:地衣芽抱桿菌(Bacillus lichenifo;rmis)H43菌株的篩選；
[0025] 1.取樣:采用無菌容器從臺南油田聯合處理站采集原油(Ξ相分離器出口管道，先 流Imin后再取樣)和±壤(去除表層覆±0.5cm后取樣），隨后放置在4°C保存備用。
[0026] 2.富集:分別取油污±壤樣品，按5%比例接入裝有lOOmL培養基（ImL微量元素溶 液加 lOmL礦物鹽溶液，加無菌水至lOOmL)的250mLS角錐形瓶中，搖床培養7d(55°C， 16化pm)。取富集液5mL轉接至相同新鮮培養基內，與相同條件下培養7d，如此連續富集培養 7次。
[0027] 3.分離:配置LB固體培養基，經高壓滅菌（12rC，20min)，取出放置超凈臺冷卻到 45°C~50°C時倒入滅菌后的90mm培養皿內（15mL)，待培養基冷卻凝固后將培養基倒置擱 放，24h后檢查無菌污染方可使用。用接種環在LB固體培養基上劃線，55Γ培養(培養皿用封 口膜密封，倒置培養）。24h后，選取不同的形態的菌，挑取單克隆于裝有1 OmL的LB液體培養 基中培養，搖床培養(55°C，160巧m)。
[0028] 4.所用培養基成分 ①無機鹽培養基： （g/L)
[0029] KH2PO4 0.5 g
[0031] W上培養基經高壓滅菌（12rc，20min)后置4Γ保存備用。
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