昆布培養基及其制造方法和昆布病原細菌感染診斷方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及用于分離棲息在昆布內的特定病原細菌的昆布培養基，更具體地說設 及能夠僅對作為引發昆布的細菌性斑點病(bacterial spot disease)的原因菌的假交替 單胞菌(Pseudoalteromonas sp.)進行分離的昆布培養基W及利用該昆布培養基的病原細 菌分離方法。
【背景技術】
[0002] 海藻類并不像高等植物那樣其根、莖和葉的區別明顯，而且其維管束不發達，從而 營養成分的攝取是在植物體整體中發生。韓國人自古就非常喜愛食用海藻類，因此對海藻 類的生產較為關注。目前，韓國擁有大規模的水產資源，其中，海藻類生產量在全體水產品 生產量中大致占25%，韓國是眾所周知的國際海藻生產國。
[0003] 海藻類之一的昆布類化aminaria)軀體分為附著器、柄和葉片，且各部分相當明 顯，整體呈竹葉狀，其長約為2~3米，寬為25~30厘米，葉子部分的中央部分為較厚的中帶 部分，而中帶部分的兩邊有一個豎溝。中帶部分外側逐漸變薄，其邊緣部分具有如水波紋狀 的較大的權皺。在生長初期的昆布中帶部分兩側邊緣，W縱向具有凹凸不平的龍紋，但隨著 生長該紋會消失，而在水中有溝的部分將朝上。
[0004] 昆布分布于暖流和寒流聚集的地區，在韓國，起初僅分布于元山W北地區，但此后 引進了日本北海道產的昆布，在室內的水槽中培養了配子體，并在東海岸和南海岸進行了 養殖。因此，可推測此后昆布在東海沿岸也有自生的。很早W前，昆布就在包括韓國在內的 日本、中國等地被食用，特別是在中國，其被作為艦的提供源，作為藥用更被珍貴使用。
[0005] 另外，在養殖昆布中發生的細菌性斑點病(bacterial spot disease)是與因表棲 動物的食害引發的斑點病不同的斑點病，它是隨著患部的擴大而使葉體枯死而脫落的疾 病。
[0006] 被感染的昆布的葉體會存在許多桐，而桐最多的部位是離葉體的基部有40~200 厘米的部位。被感染的初期，葉體的邊緣會產生孔桐，在中期其范圍會擴大，而到后期葉體 的邊緣會腐蝕并脫落，剩下的中帶部分顏色會發黃，而到末期葉體整體會完全變色并融化 掉。
[0007] 使用顯微鏡對開始出現孔桐的葉體進行鏡檢時，會發現從葉體的外側到內側由表 層細胞(直徑10~20WI1的黃綠色細胞)和線狀細胞構成，在表層的外側上多糖質的堅硬的膜 即透明的表皮層保護內部的組織。但在開有孔桐的葉體中，在表層細胞死掉而顏色變為澄 色的部位無表皮層，而且表層細胞也被脫落。隨著運種病變向周圍組織擴散而到達葉體的 背面時，會發生孔桐。
[0008] 該斑點病發病的時期為7~8月，主要因春季和夏季的降雨或河流的流入而導致的 鹽分濃度的下降或因污染物等使漁場老化時，6~8月的海水溫度比往年高或其變化較嚴 重，或者春季和夏季的氣候變化無常等引發海水的鹽分或水溫變化異常等的原因，致使昆 布的成長受到阻礙而發病。
[0009]假交替單胞菌是細菌性斑點病的原因病菌，交替單胞菌(Alteromonas)屬的細菌 根據16S rRNA遺傳基因堿基序列的差異區分為交替單胞菌(Alteromonas)屬和假交替單胞 菌（Pseudoal teromonas)屬，目前被命名為伊氏假交替單胞菌（Pseudoal teromonas elyakovii)ο
[0010] 原因菌是革蘭氏陰性、好氧桿菌，其帶有纖毛，菌體末端呈現圓形，而其大小在海 洋微生物的培養基(marine agar)中培養時為0.8皿XI.8~4μπι，可發育溫度為10~37°C (最佳為25~30°C)，在40°C中無法發育。
[0011] 最近的報告中也有在配子體中也因假交替單胞菌的感染發生絲狀體 (filamentous)的脫色、細胞膨脹和原形質體的破壞W及葉體受損而壞死的情況。因此，為 了完善對原因菌的檢查與調查，并將原因菌進行分離且分析其分類學和生理學特性，需要 可對原因菌從昆布中分離的方法。
[0012] 現有技術文獻 [oou]專利文獻
[0014] (專利文獻0001)在韓國專利公開公報第10-2001-0086897號中公開有下述內容： 由于因肺炎球菌AD出秀發的抗體與其他細菌的細胞溶解液完全不反應，而與向細胞外分泌 且在臨床上被分離的各種肺炎球菌的菌株均進行反應，所W利用向菌體外分泌且保存性高 的肺炎球菌的醇脫氨酶(曰1 coho Idehy化ogenase、ADH)或者表達該蛋白質的a化遺傳基因對 肺炎球菌進行命名確認。
[0015] (專利文獻0002)在韓國專利公開公報第10-2010-0128300號中公開有設及糖化新 技術的假交替單胞菌微生物W及該微生物分泌的瓊脂水解酶，其中，微生物生產的瓊脂水 解酶不僅具有優良的鹽穩定性，且不需要事先處理，W石花菜作為基質直接利用。
[0016] (專利文獻0003)在韓國專利公開公報第10-2004-0007121號中公開有生產對天然 多糖類的瓊脂(agar)及瓊脂糖(agarose)的α-1,3-糖巧鍵(α-1,3-glycosidic bond)進行 特異性剪切的α-瓊脂水解酶（α-agarase)的新好氧性海洋微生物的假交替單胞菌化-3 (Pseudoalteromonas sp.化-3)、該菌株分泌生產的低分子量的α-瓊脂水解酶、對其進行密 碼化的遺傳基因的堿基和氨基酸序列、和W通過制造具有抗氧化和細胞死亡誘導效果等生 理活性的瓊膠寡糖(agaro oligosaccharodes)和對電泳瓊脂糖凝膠上的DNA片段進行酶處 理而提取并分離α-瓊脂水解酶為目的可使用的新海洋微生物假交替單胞菌化-3所分泌的 低分子量的α-瓊脂水解酶的應用。
[0017] 但是，上述現有文獻與如本發明那樣僅對引起昆布的細菌性斑點病（bacterial spot disease)的原因菌的假交替單胞菌進行特異性分離的方法是不同的，對細菌的培養 和分離所使用的昆布培養基也是不同的。
【發明內容】
[0018] 發明要解決的課題
[0019] 本發明提供一種能夠僅對作為細菌性斑點病的原因體的假交替單胞菌進行特異 性分離的昆布培養基W及昆布病原細菌的分離方法。
[0020] 課題的解決手段
[0021] 本發明提供一種能夠單純培養假交替單胞菌的昆布培養基W及利用該培養基的 檢測細菌性斑點病原因體的方法。
[0022] 本發明的能夠單純培養假交替單胞菌的昆布培養基的制造方法包括下述步驟:放 入對昆布進行粉碎的粉末和NaCl并使用1L蒸饋水進行溶解后，再添加瓊脂粉（agar powder)進行溶解;對所述被溶解的溶液在高壓蒸氣滅菌器(autoclave)中在12rC下加壓 滅菌15分鐘;對經過所述滅菌過程的培養基將溫度降到60°C后，將約25ml分量的培養基放 在陪替氏培養皿(petridish)中對其進行凝固。
[0023] 使用昆布培養基的昆布病原細菌分離方法是，使用自來水和70%的酒精對昆布葉 體發生異常的部位去除附著在外部的污染源，然后，用滅菌海水按l:9(lg/9ml)進行處理并 磨碎后，在室溫下保持10分鐘，再將lOOul的上清液涂抹在根據上述方法制作的昆布培養基 上，并在20~25 °C下培養7天而對病原細菌進行分離。
[0024] 發明的效果
[0025] 使用本發明的昆布培養基的昆布病原細菌分離方法通過特異分離作為細菌性斑 點病的原因菌的假交替單胞菌，W此具有能夠應用于昆布疾病診斷及斑點病預報系統的效 果。
【附圖說明】
[0026] 圖1為表示本發明的昆布培養基。
[0027] 圖2為表示利用本發明的昆布培養基的昆布病原細菌的分離照片。
[0028] 圖3為表示包括本發明的昆布培養基的按照培養基種類培養后分離的病原細菌。
【具體實施方式】
[0029] 為實現本發明的發明目的，本發明包括:昆布培養基W昆布粉末為有效組成成分、 將規定量的化C1在該粉末和蒸饋水中溶解而形成的昆布培養基的制造過程;在受到細菌性 斑點病感染的昆布中對病原細菌進行處理，并將其在包括本發明的昆布培養基的多個培養 基中進行培養而對昆布病原細菌進行分離的過程;使用培養的試料并利用特定的引物來命 名確認細菌的過程。
[0030] W下，W實施例為中屯、就利用昆布培養基的昆布病原細菌分離方法進行說明，但 本發明并非限于此。
[0031] 實施例1昆布固體培養基的制造方法
[0032] 圖1表示本發明的昆布培養基。本發明的昆布固體培養基的制造過程中昆布粉末 的制造工序包括:采取并篩選合適的昆布原材料的采取和篩選