一株低溫生防菌株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，設及一株低溫生防菌株及其應用。
【背景技術】
[0002] 農作物病害是農業生產上的一種自然災害，直接影響作物的產量和品質，造成的 損失十分巨大。由于化學農藥抗藥性和污染問題的日益嚴重，環境友好的微生物農藥成為 農作物病害防治的重要手段。目前，微生物農藥W活菌制劑為主，應用中防效不穩定是共性 問題。生防菌能否在±壤環境中生存和繁殖是影響其實際防病效果的關鍵。由于通常的播 種時節是在±壤溫度較低的早春或秋季，現在所用的微生物農藥菌株均為常溫菌，在低溫 條件下生長緩慢或停止生長，降低了生物農藥的應用效果，阻礙微生物農藥的廣泛推廣應 用，因此低溫生防菌株的獲得可為低溫適生性生物菌肥及生物農藥的研發提供優質的菌源 材料，在生物防治中具有潛在的研究及開發優勢。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一株低溫生防菌株，該生防菌能夠在低溫條件下生長繁殖， 能夠產生隧鐵素、幾下質酶、脂膚類和蛋白類等多種抗菌物質，還具有降解纖維素能力。該 菌株抑菌譜廣，能夠抑制大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米莖基腐病菌、水稻惡苗病菌、水 稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、馬鈴馨絲核病菌、刺五加根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病 菌等病原真菌W及病原細菌(煙草細菌性病害角斑病菌），而且還具有促進植物生長功能。
[0004] 本發明的目的是通過W下技術方案實現的：
[0005] 一株低溫生防菌株，其為甲基營養型芽抱桿菌（Bacillus methylotrophicus) WSWGH-10,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC No. 11541，保藏日期為2015年10月21日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路1號院3號。
[0006] 甲基營養型芽抱桿菌（Bacillus methylotro地icus)WSWGH-10形態特性：革蘭氏 陽性好氧菌，桿狀，有芽抱，大小為0.2~0.5X1.0~1.5μπι;菌落白色圓形，皺權。
[0007] 甲基營養型芽抱桿菌（Bacillus methylotro地icus)WSWGH-10生理生化特性：利 用葡萄糖，氧化酶、接觸酶、M.R、明膠液化、淀粉水解、巧樣酸鹽利用、硝酸鹽還原、嗎I噪產生 和石蕊牛奶均為陽性，V.P和尿素酶陰性;生長溫度范圍6~30°C，最適生長溫度20°C。
[000引甲基營養型芽抱桿菌（Bacillus methylotro曲icus)WSWGH-10分子生物學鑒定結 果:通過16S rDNA序列和看家基因 gy巧序列比對，與甲基營養型芽抱桿菌同源性為99%。 [0009] 本發明的甲基營養型芽抱桿菌(Bacillus methylotro地icus)WSWGH-10能夠產生 隧鐵素、幾下質酶、脂膚類和蛋白類等多種抗菌物質，還具有降解纖維素能力。
[0010] 本發明的甲基營養型芽抱桿菌（Bacillus methylotro地icus)WSWGH-10能夠在低 溫條件l〇°C有效抑制大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米莖基腐病菌、水稻惡苗病菌、水稻 稻曲病菌、水稻立枯病菌、馬鈴馨絲核病菌、刺五加根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌 等病原真菌W及病原細菌(煙草細菌性病害角斑病菌）的生長，抑制率大于82%，抑菌譜廣， 抑菌率高。
[0011] 本發明的甲基營養型芽抱桿菌（Bacillus methylotro地icus)WSWGH-10具有促進 植物生長功能，其50倍和100倍稀釋液能夠促進玉米種子發芽，發芽率為90.3 %和94.5 %， 大于空白對照(88.2%)，并且芽長、根長和根數顯著大于空白對照。
[0012] 保藏信息：
[0013] 分類命名：甲基營養型芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus);
[0014] 保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、；
[001引保藏編號：CGMCC No. 11541;
[0016] 保藏日期:2015年10月21日；
[0017] 保藏地址:北京市朝陽區北辰路1號院3號。
【附圖說明】
[001引圖1為菌體形態；
[0019] 圖2為菌落形態；
[0020] 圖3為菌株16s rRNA系統進化樹；
[0021] 圖4為菌株gy巧基因系統進化樹；
[0022] 圖5為菌株分泌隧鐵素能力檢測；
[0023] 圖6為菌株分泌纖維素酶能力檢測；
[0024] 圖7為菌株分泌幾下質酶能力檢測；
[0025] 圖8為菌株分泌蛋白酶能力檢測；
[0026] 圖9為抗菌蛋白抑菌活性測定；
[0027] 圖10為脂膚類抗生素抑菌活性測定；
[0028] 圖11為菌株對煙草角斑病菌的抑制結果；
[0029] 圖12為菌株促進玉米種子發芽結果。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發明的保護范圍中。
[0031 ]本發明提供了 一株低溫生防菌株及其應用，具體內容如下：
[0032] 1)低溫生防菌株的篩選鑒定：
[0033] 低溫生防菌株WSWGH-10是從黑龍江省鶴崗地區冬季凍±中分離篩選得到。篩選按 W下方法進行:取5肖凍±解凍后研碎，放入含有50ml無菌水的Ξ角瓶中，10°C震蕩化，用無 菌水稀釋至1〇-7,分別取1〇-5、1〇-哺1〇-7稀疏度的菌液0.1ml涂布在LB平板上，10°C培養箱中 靜置培養3~7d，挑單菌落劃線轉接新的LB平板，1(TC培養箱中靜置培養3~7cLW大豆根腐 病菌為指示菌，采用對時培養方法篩選生防菌株，即可獲得低溫生防菌株。
[0034] 對菌株進行形態、培養特性和生理生化特性鑒定，具體步驟如下:將低溫培養24小 時的菌體進行革蘭氏染色后在400倍顯微鏡下觀察菌體大小;將菌液倍比稀釋后涂布在LB 培養基平板上，觀察菌落形態和顏色;將菌株進行氧化酶，接觸酶，葡萄糖發酵，V. P，M. R，淀 粉水解、尿素酶、巧樣酸鹽利用、硝酸鹽還原、嗎I噪產生、明膠液化和石蕊牛奶試驗，結果表 明該菌株為革蘭氏陽性好氧菌，桿狀，有芽抱，大小為0.2~0.5 X 1.0~1.5μπι(圖1);菌落白 色圓形，皺權（圖2);能夠利用葡萄糖;氧化酶、接觸酶、M.R、明膠液化、淀粉水解、巧樣酸鹽 利用、硝酸鹽還原、嗎I噪產生和石蕊牛奶均為陽性，V.P和尿素酶陰性。生長溫度范圍6~30 °C，最適生長溫度20°C。
[0035] 對菌株進行16S rDNA序列分析和看家基因 gy巧分析:取ImL菌液離屯、收集菌體，用 細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN BI0TECH)提取基因組DNA，W基因組DNA為模板，分別 W le