SrDNA通用引物和芽抱桿菌gy巧基因通用引物進行PCR擴增，將PCR產物進行瓊脂糖凝 膠電泳，將特異DNA條帶進行測序，在GenBank中進行同源序列比對，用Mega 5.0軟件構建系 統發育樹（圖3~4)，結果與甲基營養型芽抱桿菌的16S rDNA序列和gyrB基因同源性為 99 %，結合形態、培養特性和生理生化特性，鑒定為甲基營養型芽抱桿菌Bacillus methylotrophicuso
[0036] 2)菌株分泌蛋白酶、纖維素酶、幾下質酶和隧鐵素能力檢測：
[0037] 采用蛋白酶、纖維素酶、幾下質酶和隧鐵素鑒別平板法檢測該菌株是否能夠產生 蛋白酶、纖維素酶、幾下質酶和隧鐵素。蛋白酶檢測:將菌株接種在蛋白酶檢測培養基平板 上(脫脂奶粉1 %，牛肉膏0.3%，蛋白腺1 %，氯化鋼0.5% )，10°C培養3~7d，觀察有無酶解 透明圈。纖維素酶檢測：將菌株接種在纖維素剛果紅培養基上(硫酸錠0.2%，憐酸二氨鐘 0.1 %，氯化鋼0.05%，纖維素粉2%，剛果紅0.02%，瓊脂粉2% )，10°C培養3~7d，觀察有無 酶解圈。幾下質酶檢測:將菌株接種在幾下質培養上(膠體幾下質1%，蛋白腺0.2%，酵母粉 0.2%，硫酸儀0.02%，硫酸鐵0.001 %憐酸氨二鐘0.07%，憐酸二氨鐘0.03%，剛果紅 0.02%，瓊脂粉2%)10°(：培養3~7(1，觀察有無酶解圈。隧鐵素檢測:將菌株接種〔45-平板， 10°C培養3~7d，觀察有無酶解圈。結果表明該菌株能夠分泌蛋白酶、纖維素酶、幾下質酶和 隧鐵素，說明該菌株不僅具有生防功能還具有降解纖維素和蛋白的能力（圖5-8)。
[0038] 3)低溫生防菌的抗菌物質確定：
[0039] 抗菌蛋白：將菌株在LB培養基中10°C、170r/min培養3d，40(K)r/mim離屯、，收集上清 液，采用硫酸錠分級沉淀方法獲得蛋白，先加硫酸錠至30%飽和度，4°C過夜沉淀，lOOOOr/ mim離屯、20min，收集沉淀，得沉淀I。上清液再加入硫酸錠至50 %、70 %和90 %飽和度，4 °C過 夜沉淀，lOOOOr/mim離屯、20min，收集沉淀II、ΙΠ 和IV，用PBS緩沖液溶解，透析除鹽，濃縮后 W大豆根腐病菌為指示菌檢測抑菌活性，結果表明沉淀Π 、ΙΠ 和IV都具有抑菌活性（圖9)， 說明該菌株能夠產生多種抗菌蛋白。
[0040] 脂膚類抗生素:將菌株在LB培養基中10°C、170r/min培養3d，400化/mim離屯、，收集 上清液，采用鹽酸沉淀法獲得脂膚類抗生素。向上清液中加入濃鹽酸至pH 2,4°C放置過夜， 次日100(K)r/mim離屯、20min，收集沉淀，用甲醇抽提，采用紙片法W大豆根腐病菌為指示菌 檢測抑菌活性，結果脂膚類抗生素具有抑菌活性（圖10)，說明該菌株還能夠產生脂膚類抗 生素。
[0041 ] 4)低溫生防菌的抑菌譜測定：
[0042] 采用菌絲生長速度法測定菌株WSWHG-10對10種植物病原真菌(大豆根腐病菌、大 豆菌核病菌、玉米莖基腐病菌、水稻惡苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、馬鈴馨絲核病 菌、刺五加根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌)抑制情況。取0.1ml低溫培養4化菌液涂 布于PDA平板上，在平板中屯、接種病原菌菌絲塊(直徑5mm)，涂布無菌水作對照，10°C培養 7d，測定菌落直徑，按W下公式計算抑菌率。抑菌率％=對照組菌落直徑-對照組菌落直徑/ 對照組菌落直徑X100%。結果表明該菌株對10種病原真菌具有很好的抑制效果，抑制率達 82.0~90.3 % (表1)，說明該菌株抑菌譜廣，抑菌能力強。
[0043] 表1菌株對病原真菌的抑菌結果
[0044]
[0045] 采用抑菌圈法測定菌株WSWHG-10對引起煙草細菌性病害的病原菌（角斑病菌）的 抑制情況，取0.1ml病原細菌涂布于LB平板上，在中屯、放滅菌鋼圈，在鋼圈中加入0.05ml生 防菌液，l〇°C培養7d，觀察有無抑菌圈，結果在鋼圈周圍有抑菌圈，說明生防菌WSWHG-10能 夠抑制該病原細菌生長（圖11)。W上結果說明該菌株抑菌譜廣，不僅對多種植物病原真菌 具有很強的抑制作用，對細菌性病害也有很好的抑制作用。
[0046] 5)低溫生防菌的促生長測定：
[0047] 將培養4她的菌液用無菌水稀釋50和100倍，將玉米種子浸泡在2個處理液中4d，取 出放于含水濾紙上，28°C保濕培養3d，計算發芽率，W清水處理為對照。結果表明50和100倍 稀釋液促進種子發芽，發芽率為90.3%和94.5%，大于空白對照(88.2%)，并且芽長、根長 和根數顯著大于空白對照(表2,圖12)。
[0048] 表2菌株對玉米種子發芽的影響
[0049]
【主權項】
1. 一株低溫生防菌株，其分類命名為甲基營養型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus，保藏編號為CGMCC No. 11541。2. 權利要求1所述低溫生防菌株在低溫條件抑制植物病原真菌以及煙草細菌性病害角 斑病菌生長中的應用。3. 根據權利要求2所述的低溫生防菌株在低溫條件抑制植物病原真菌以及病原細菌生 長中的應用，其特征在于所述低溫溫度為l〇°C。4. 根據權利要求2所述的低溫生防菌株在低溫條件抑制植物病原真菌以及病原細菌生 長中的應用，其特征在于所述植物病原真菌為大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米莖基腐病 菌、水稻惡苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、馬鈴薯絲核病菌、刺五加根腐病菌、黃瓜 枯萎病菌、番茄灰霉病菌，病原細菌為煙草細菌性病害角斑病菌。5. 權利要求1所述低溫生防菌株在促進植物生長中的應用。6. 權利要求1所述低溫生防菌株在降解纖維素和蛋白中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一株低溫生防菌株及其應用，所述低溫生防菌株為甲基營養型芽孢桿菌(Bacillus？methylotrophicus)WSWGH-10，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.11541，保藏日期為2015年10月21日，保藏地址為北京市朝陽區北辰路1號院3號。該生防菌能夠在低溫條件下生長繁殖，能夠產生噬鐵素、幾丁質酶、脂肽類和蛋白類等多種抗菌物質，還具有降解纖維素能力。該菌株抑菌譜廣，能夠抑制大豆根腐病菌、大豆菌核病菌、玉米莖基腐病菌、水稻惡苗病菌、水稻稻曲病菌、水稻立枯病菌、馬鈴薯絲核病菌、刺五加根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌等病原真菌以及病原細菌(煙草細菌性病害角斑病菌)，而且還具有促進植物生長功能。CGMCC No. 1154120151021
【IPC分類】A01P3/00, A01P1/00, C12R1/07, C12N1/20
【公開號】CN105670958
【申請號】
【發明人】張淑梅, 劉宇帥, 姜威, 陳靜宇, 孟利強, 胡基華, 李晶, 曹旭
【申請人】黑龍江省科學院微生物研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年11月10日