擴增ΡΒ2基因（登錄號:DQ465397.1)的引物對的下游引物。
[0037] 圖1:是本發明中設及的PHW2000原始質粒圖譜。該質粒是用來構建反向遺傳操作 的8個質粒的原始質粒。
[003引圖2:流感病毒各片段cDNA克隆到pHW2000載體構建示意圖。
[0039] 圖3:流感病毒HA3-5-8突變體構建示意圖。
[0040] 圖4:是本發明設及W1毒株全基因序列克隆的PCR圖。附圖標記說明：泳道從左至右 依次為:DL15000marker; PB2、PBI、PA; DL2000marker; HA、NP、NA; DL2000marker; Μ，NS。
[OOW 圖5: HA基因（登陸號:DQ465400) 3-5-8位點突變的PCR圖。附圖標記說明：泳道依次 為:Plus 2000marker;PHW2000-HA3-5-8的質粒擴增電泳結果。
[0042] 圖6:是本發明制備的突變毒株在MDCK細胞上增殖傳代的結果。 具體實施方案
[0043] 實施例1:禽流感病毒分離株A/chicken/化bei/Wl/2004毒株全基因組感染性克隆
[0044] 1、禽流感病毒分離株 A/chicken/Hubei/Wl/2004RNA 的提取
[0045] 從-80°C冰箱中取出備用的雞胚尿囊液禽流感病毒分離株A/cMcken/化bei/Wl/ 2004(簡稱病毒），【參見：Xiao-化anXu,Gao-YuanXu,Hong-BoZhou,Zheng-化n Yu.Evolutionary characterization of influenza virus A/duck/Hubei/Wl/2004 (H9N2)isolated from central 畑inaVirus Genes.2008 Feb;36(l):79-83.Epub 2007NOV 20】置于室溫下溶解，取3(K)化病毒液加入到裝有1血Trizol 1.5血EP管中，輕輕 的上下顛倒，放在冰上冰浴15min;然后加入2(Κ)化氯仿，用振蕩器滿旋混勻15s，放置冰上靜 置lOmin, W4°C，12000;r/min離屯、lOmin，取上清(避免吸到白色沉淀)移入新的一個1.5mLEP 管，加等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，室溫放置lOmin，室溫1200化/min離屯、lOmin，棄上 清，加 ImL 75 %乙醇，室溫1200化/min離屯、lOmin，吸棄乙醇，將EP管置于超凈臺中風干，最 后將RNA沉淀溶于10μ1的DEPC水，置-80°C保存備用（一般采用立即反轉效果較好，避免RNA 被空氣中的RNA酶降解）。
[0046] 2、引物設計合成
[0047] 用來擴增所有A型流感病毒8個全長基因片段的通用引物如下所示。引物由上海生 物工程有限公司合成，具體引物的核巧酸序列如下：
[004引反轉錄通用引物化11化'山6。5'46〔44446〔466 3'（沈9 10^:9)
[0049] (1)擴增HA基因（登錄號:DQ465400.1)的引物對：
[0050] P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG 3'（沈Q ID N0:10)
[0051] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3'（沈Q ID N0:11)
[0化2] (2)擴增ΝΑ基因（登錄號:DQ465402.1)的引物對：
[0053] Ρ1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT 3'（沈Q ID Ν0:12)
[0054] Ρ2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT 3'（沈Q ID Ν0:13)
[0055] (3)擴增M基因（登錄號:DQ465403.1)的引物對：
[0056] P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG 3'（沈Q ID N0:14)
[0057] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT 3'（沈Q ID N0:15)
[0化引 （4)擴增NP基因（登錄號:DQ465401.1)的引物對：
[0059] P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA 3'（沈Q ID N0:16)
[0060] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT 3'（沈Q ID N0:17)
[0061 ] (5)擴增NS基因（登錄號:DQ465404.1)的引物對：
[0062] P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG 3'（沈Q ID N0:18)
[0063] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT 3'（沈Q ID N0:19)
[0064] (6)擴增PA基因（登錄號:DQ465399.1)的引物對：
[00化]P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC 3'（沈Q ID N0:20)
[0066] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT 3'（沈Q ID NO:21)
[0067] (7)擴增PBl基因（登錄號:DQ465398.1)的引物對：
[006引 P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA 3'（沈Q ID N0:22)
[0069] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT 3'（沈Q ID N0:23)
[0070] (8)擴增PB2基因（登錄號:DQ465397.1)的引物對：
[0071] P1 5'TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTC 3'（沈Q ID N0:24)
[0072] P2 5'ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT 3'（沈Q ID N0:5)
[0073] 3、禽流感 A/chicken/Hubei/Wl/2004病毒 RNA 的反轉錄
[0074] 在20μ1反轉錄體系中進行，依次加入如表1所述的組分，混勻后置PCR儀上于42°C 進行反轉錄反應60min，反應產物直接用于PCR或置于4°C保存備用。
[0075] 表1:禽流感病毒A/chicken/Hubei/Wl/2004病毒RNA的反轉錄體系
[0076]
[0077] 4、禽流感病毒 A/chicken/Hubei/Wl/2004cDNA 的 PCR 擴增
[007引在PCR反應管中加入表2所述的擴增體系。將配置好的體系混勻后于PCR儀上進行 擴增。PCR擴增程序為預變性94°C5min，變性94°C20sec，退火58°C30sec，延伸72°C5min，運 行30個循環，最后于72°C后延伸lOmin。同時設無模板的陰性對照。反應結束后，PCR產物各 取化1，在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，剩余置4°C保存備用。
[00巧]表2:禽流感病毒A/chicken/Hubei/Wl/2004cDNA的PCR擴增體系 [0080]
[0081 ] 5、PCR產物的回收與純化
[0082] 電泳結束后在紫外光下從凝膠上切下目的DNA片段的瓊脂糖凝膠，用DNA快速回收 試劑盒(購自上海生工生物工程有限公司）回收DNA。具體方法如下：切下目的DNA回收片段， 放入一無菌的1.5mL的EP管中，加入500-750μ1 Binding Buffer，于50-60°C水浴5min，其間 輕彈EP管，使凝膠完全溶化。然后將溶化的液體轉至一回收柱，于室溫靜置2min，800化/ min，離屯、Imin，倒掉收集管中的廢液，用500ylWashing solution SOOOr/min，離屯、Imin，洗 兩次；最后120(K)r/min離屯、15s，將回收柱轉至一干凈的1.5血EP管中，加10-20μ1 d地2〇洗 脫，于室溫放置5min，12000r/min離屯、Imin，收集管中即為回收的DNA片段，可直接用于DNA 連接，也可于-20°C保存備用。
[0083] 6、連接反應
[0084] 將回收的PCR產物直接連至IjpMD 18-T載體(購自寶生物工程大連有限公司），連接體 系如表3。體系配置好后，將連接體系放于16°C水浴中過夜連接。
[0085] 表3連接體系
[0086]
[0087] 7、連接產物的轉化
[0088] 取10化1新鮮制備的感受態細胞D冊α置于冰上。加入1〇μ1連接產物，混勻后，冰浴 30miru42°C熱激90s，冰浴2min，使之冷卻。加入400μ1 LB混勻，220r/min，37°C搖床培養 45min后于5000r/min離屯、5分鐘，吸棄30化1上清，重懸菌體后吸取20化1培養液，涂布抗性 平板上。37 °C培養1 Oh -1化可出現單菌落。
[0089] 8、PCR鑒定陽性重組質粒
[0090] PCR篩選陽性克隆的程序如下：取滅菌的0.5ml的EP管8-12個，依次在每管中加入 30μ1的滅菌雙蒸水。用滅菌槍頭刮取平皿上的單菌落，在EP管中吹吸幾次使菌體懸浮在雙 蒸水中。每個樣品無菌取10μ1菌體懸液W備進一