[0144] 3、八個質粒的共轉染
[0145] 將10化脂質體（lipofectin)轉染試劑按說明書介紹的方法稀釋到90化無血清培 養基0PTI-MEM(購自GIBC0公司）中，室溫放置5min，另將2-：3yg混合質粒(含PB2:PB1: PA:HA: NP:NA:M:NS(濃度比為1:1:0.5 :1:1:1:1:1)稀釋至100μΙ無血清培養基0PTI-MEM(購自 GIBC0公司）中。然后將稀釋的脂質體(lipofectin)(購自Invitrogen公司）緩慢滴加至混合 質粒中，輕輕吹吸10余次，充分混勻，室溫結合20min，同時設lipofectin對照，缺失一個或 幾個質粒的對照。將6孔組織培養板中已培養約18-24h，80 % -90 %豐度、分布均勻、生長狀 況好的293T+MDCK細胞。用無血清、無抗生素的DMEM培養基洗兩次后，再用0PTI-MEM培養基 洗一次，最后加入50化L 0PTI-MEM培養基（購自GIBC0公司）覆蓋于細胞上；加入質粒與 lipofectin(購自Invitrogen公司）的結合物(共20化1)，使其均勻覆蓋于細胞上，在37°C， 5 %C〇2培養箱中吸附化，換入含10 %血清的DMEM培養基1血，3化后用憐酸鹽緩沖液(PBS，為 常用緩沖液)洗兩次，最后加入含終濃度為2.扣g/mLTPCK膜酶(購自上海生工生物工程有限 公司）的無血清DMEM培養基ImL，7化后小屯、吹落細胞，與上清一起收集。
[0146] 4、W1-HA358禽流感病毒的增殖和鑒定
[0147] 將轉染后收集的細胞及上清中加入適量的雙抗（氨節霉素50mg/ml和卡那霉素 50mg/ml)，充分混勻后，W0.2ml/胚的量接種9-11日齡的SPF雞胚(購自北京梅里亞維通動 物實驗技術有限公司），置37°C培養，每日觀察雞胚的死亡情況，適時收集雞胚尿囊液，然后 用紅細胞測其血凝價，保存在-80°C冰箱中。在雞胚上盲傳 Ξ代，使W1-HA358禽流感病毒在 其上穩定增殖。
[014引 5、W1-HA358禽流感病毒的細胞感染實驗及其在MDCK細胞上的傳代
[0149] 將MDCK細胞培養至單層后傳代，將吹散的細胞均勻接入6孔組織培養板中，在37 °C，5%C02培養箱中培養至細胞豐度達90%W上。將細胞中的培養基棄去后，用PBS洗兩次， 再用無血清的DMEM將細胞洗一次后，加入用DMEM稀釋成1〇-1的尿囊液，于37°C，5%C〇2培養 箱中吸附化后，加入含1.化g/ml膜酶的無血清的DMEM維持液，置37 °C，5 %C〇2培養箱中培 養。每隔2地取25化孔上清，測定血凝價。用同樣的方法，取上一代的W1-HA358禽流感病毒繼 續傳代，直至W1-HA358禽流感病毒在細胞上能穩定增殖(增殖結果如圖4所示）。
[0150] 6、禽流感病毒株W1-358和禽流感野毒株W1組織半數致感染量(TCI化0)的測定
[0151] 將MDCK細胞培養至單層后傳代，將吹散的細胞均勻接入96孔組織培養板中每孔 10化L，在37 °C，5 % C〇2培養箱中培養至細胞豐度達90 % W上。將細胞中的培養基棄去后，用 PBS洗兩次。加入用取凍于-80°C冰箱病毒尿囊液，用無血清DMEM培養基將禽流感病毒從10-? 稀釋到1〇-6,每個稀釋度病毒接種8孔(0.1血/孔）。做兩個重復，放于37°C溫箱解育72h，檢測 細胞培養基上清血凝價，按Reed-Muench法公式計算半數感染量(結果如表7和表8)。
[0152] 計算按Reed和Muench法計算：
[0153] 距離比例=(高于50%病變率的百分數-50% )/((高于50%病變率的百分數-低于 50%病變率的百分數）
[0154] TCI化0的對數=高于50%病毒稀釋度的對數+距離比例X稀釋系數的對數。
[01巧]表7禽流感野毒株W1的TCIDso
[0156]
[0159] 7、禽流感病毒雞胚半數致死量化LDso)的測定
[0160] 取凍于-80°C冰箱禽流感病毒尿囊液，用無菌PBS將禽流感病毒從10-2稀釋到10-7， 每個稀釋度病毒接種5枚雞胚(0.2mL/枚），放于37°C溫箱解育72h，在2地內死亡的舍棄，然 后將雞胚放在4 °C冰箱過夜，檢測尿囊液血凝性，按Reed-Muench法公式計算半數致死量(結 果見表9和表10)。
[0161] 表9禽流感病毒突變株W1-HA358的ELDso
[0162]
[0165] 表9和表10結果表明，病毒稀釋度為10-5時，突變株W1-HA358的毒力相比野毒株W1- 358毒力明顯下降。
[0166] 主要參考文獻
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【主權項】
1. 一株人工突變的具有免疫原性的H9N2亞型禽流感病毒突變株W1-HA358,保藏在中國 典型培養物保藏中心，其保藏號為:CCTCC NO:V201522。2. 權利要求1所述的一株人工突變的具有免疫原性的H9N2亞型禽流感病毒突變株W1-HA358制備的H9N2亞型禽流感細胞苗。3. 權利要求1所述的一株人工突變的具有免疫原性的H9N2亞型禽流感病毒突變株W1-HA358在制備的H9N2亞型禽流感細胞苗中的應用。
【專利摘要】本發明屬于動物疫苗制備技術領域。具體涉及H9N2亞型禽流感病毒細胞高產疫苗株構建及應用。所述的疫苗株是由禽流感分離株通過人工誘變篩選得到。該疫苗株被命名為H9N2亞型禽流感病毒W1‐HA358毒株，其原始分離株為A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2))株。對該分離株的HA基因非編碼區3ˊ端的3,5,8位點進行了人工定點突變，利用反向遺傳操作拯救出突變株，突變株在MDCK細胞上傳代至穩定后得到高增殖滴度的毒株，得到H9N2亞型禽流感病毒細胞苗。本發明解決了H9N2禽流感病毒在MDCK細胞上增殖不穩定問題，克服了禽流感爆發時大量雞胚的短缺問題，提高了疫苗的制備效率。CCTCC NO：V20152220150611
【IPC分類】A61P31/16, C12N7/00, A61K39/145
【公開號】CN105671002
【申請號】
【發明人】周紅波, 金梅林, 白繞仙, 王玉剛, 李國利, 康超, 陽姹
【申請人】華中農業大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年10月9日