步擴大培養用，剩余的20μ1用沸水水浴 10min，1200化/min離屯、5min，取上清扣1作PCR模板。PCR擴增出預期目的片段的樣品，取其 相應的菌體懸液擴大培養，制備質粒測序用。用于鑒定的PCR程序與擴增該基因的程序相 同，具體PCR體系如表4。
[0091] 表4 PCR鑒定體系
[0092] _
[0093] ~將上述篩選得到的陽性克隆的8個基因，每個基因選擇4個樣品送上海生工生物工' 程有限公司進行測序，然后使用軟件DNAStar4.0對測序的序列進行比對分析。
[0094] 9、質粒小提
[00M]采用質粒提取試劑盒(購自北京全式金生物技術有限公司）
[0096] (1)隨機挑取平板上轉化的單個菌落，接種至5mL含抗生素(Amp，終濃度為0.1 % ) 的LB培養液中，37°C300r/min振蕩培養過夜；
[0097] (2)取2mL菌液加入一個新的EP管中，W1200化/min離屯、2min，收集菌體，直至培養 液收集完，棄去上清，收集沉淀；
[009引（3)加入25化L P1溶液(試劑盒自帶）（使用前加入化aseA，放于4°C冰箱保存，）重 懸菌體沉淀，至菌體徹底重懸均勻；
[0099] (4)加入25化L P2溶液(試劑盒自帶），然后溫和地上下翻轉4-7次均勻混合，使菌 體完全裂解，室溫放置；
[0100] (4)加入35化L P3溶液(試劑盒自帶），立即溫和地上下翻轉4-7次混合均勻，直至 出現白色絮狀沉淀，待液體顏色由黃色為透明即可；然后在室溫下Wl2000r/min離屯、 lOmin，小屯、吸取上清，盡量不要吸入沉淀；
[0101] (5)將上一步所得上清加入吸附柱中（吸附柱已放入收集管中），在室溫下靜置 2min，然后Wl20(K)r/mim離屯、60s，倒掉收集管中的廢液。如果所得上清體積大于75化L，可 W分多次加入吸附柱中，再次離屯、，倒掉廢液即可；
[0102] (6)往吸附柱中加入600yL的Washing Buffer，W120001·/mim離屯、Imin,倒掉收集 管中的廢液；
[0103] (7)重復步驟(6);
[0104] (8)將吸附柱再次放入收集管中，12000r/min離屯、2min，盡量完全去除Washing Buff er，W免其中的殘留乙醇影響；
[0105] (9)取出吸附柱，放入一個干凈新的EP管中，在吸附膜的中間部分懸空加入加 so- so 化洗脫緩沖液巧 lution buffer; 洗脫緩沖液的來源或提供其配方及配置方法，使用洗脫 緩沖液前在65-75Γ水浴加熱之后洗脫效果更好），室溫放置2min，W 120(K)r/min離屯、3min， 收集質粒DM;
[0106] (10)取0.化L DM質粒用紫外分光光度計檢測濃度后于-20°c保存備用。
[0107] 10、PHW2000重組質粒的構建
[010引將上述提取的質粒進行酶切，同時用BsmBI線性化載體pHW2000(美國Stjude兒童 研究醫院胖663*64専±惠贈，質粒圖譜如圖1所示）。其中PB1、PA、HA、NA、M及NS基因片段（片 段序列同《【附圖說明】》所示的序列）用BsmBI酶切，回收后同線性化的載體PHW2000相連。用 BsmBI酶切PB2基因片段后，產生1.9kb和0.4kb兩條帶；用Bsal酶切NP基因片段產生1.化b和 0.4化兩條帶。將兩條帶一起回收后分別與線性化的載體抑W2000相連，對Ξ個片段進行連 接。用連接產物轉化大腸桿菌DH 5α感受態細胞，轉化后挑取單個菌落，搖菌，小提質粒。用 酶切和PCR方法(采用常規方法)來篩選陽性克隆子。將所得的陽性克隆子送上海生工生物 工程有限公司鑒定后證明序列連接正確。
[0109] 11、結果
[0110] (1)W1毒株全基因組克隆
[0111] 利用步驟2(引物設計合成）中公開的8對引物擴增全基因組序列(PB1、PB2、PA、HA、 NP、NA、M、NS)目標基因，得到W1流感病毒株基因的8個片段，片段大小為依次約為2.3kb、 2.3化、2.2化、1.7化、1.5化、1.4化、1.0化和0.9化（見圖2所示）。
[0112] 構建 PHW2000-HA358 突變質粒
[0113] 由上海生物工程有限公司合成HA3-5-8位點突變的引物，引物的核巧酸序列如5所 示：
[0114] 表5 HA3-5-8位點突變的引物
[0115]
[0116] 設計一對含突變點有10個堿基反向互補的引物，如表5所述。用高保真的DNA聚合 primerStar PCR擴增全質粒DNA化A-PHW2000)，跑膠鑒定（結果見圖3)，用Dpnl酶處理3.化 去除未甲基化模板質粒，轉化后挑幾個菌落測序鑒定突變位點。PCR體系如表6:
[0117] 表6 PCR體系
[0118] _
[0119] 實施例2:突變毒株W1-HA358禽流感病毒的捶救及其生物學特性觀察
[0120] 1、去內毒素質粒的提取
[0121 ] 采用Omega公司生產的無內毒素超純質粒小提試劑盒化ndo-free Plasmid Mini Kit II)提取質粒。具體步驟如下：
[0122] (1)將PHW2000-PB1，P麗2000-PB2，P麗2000-PA，P麗2000-HA358，PHW2000-NA， PHW2000-NP，PHW200-M，PHW2000-NS八個已構建好的質粒保存的大腸桿菌菌液接種于lOOmL 的LB液體培養基中，然后在37 °C搖床過夜培養大腸桿菌12-1化。
[0123] (2)將所有lOOmL菌液加入50mL離屯、管中，配平，在4°C，12000r/min離屯、8min棄去 培養基上清，收集菌體。
[0124] (3)棄上清，向沉淀中加入適量生理鹽水或者PBS重懸菌體，分裝到2mL的EP管中， 在4°C，12000r/min離屯、2min棄去培養基上清，收集菌體。
[01巧](4)棄上清，加入500化的SolutionI溶液(加入RNaseA)重懸菌體。
[01%] (5)加入50化L的Solutionll溶液，輕輕顛倒混勻7-10次，直至上清清亮（提前將 buffer N3放在冰上，離屯、機降溫至4°C。
[0127] (6)加入25化L冰浴的Buffer N3(試劑盒自帶），并溫和地上下顛倒離屯、管數次至 白色絮狀沉淀形成為止(上層若有黃色塊狀物，則是未裂解的菌體），然后在4°C，12000r/ min 離屯、lOmin。
[012引 （7)將上清轉移到新的1.5mL的EP管中，再次W4°C，12000r/min離屯、2min。
[0129] (8)將上清轉移到新的1.5mL的EP管中，加入0.1倍體積的ETR，輕輕混勻后放在冰 上lOmin，每隔2min顛倒幾次化TR為藍色溶液，裝于白色瓶子中，保存于4°C冰箱，此液體較 粘稠，慢慢的吸取，用于去內毒素）。
[0130] (9)在冰上放置后，液體清亮，再放到42°C水浴鍋中5min，此時液體再次變渾濁，在 室溫下W12000r/min離屯、lOmin，此時ETR沉于管底。
[0131] (10)將上清轉移到新的2mL EP管中，加入0.5倍體積的無水乙醇，混勻，靜置2min;
[0132] (11)把HiBind DNA Min柱中提前加入200-300μΙ buffer GPS浸潤，靜置5min，在 室溫下W120(K)r/min離屯、30-60S，倒掉收集管中的液體；
[0133] (12)將步驟(10)中的溶液轉入新的浸潤過的化Bind DNA Min柱，每次7(K)yL，靜置 2min，W120001·/min離屯、30-60s;
[0134] (13)棄掉收集管中的液體，加入500μΙ buffer皿洗柱子，室溫下^12000萬/1111〇離 屯、3〇-60s;
[0135] (14)棄掉收集管中的液體，加入700化洗脫緩沖液(washing buffer)(加乙醇）洗 柱子，室溫下Wl2000;r/min離屯、3〇-60s;
[0136] (15)重復步驟(14);
[0137] (16)把柱子重新放回收集管中，室溫下Wl20(K)r/min離屯、2min;
[0138] (17)將柱子放入新的1.5mL EP管中，放于42°C溫箱中5min，同時將無內毒素洗脫 緩沖液化ndo-打ee Elution buffer)放入烘箱中；
[0139] (18)取70-100化邸洗脫液，加入到柱子中央，靜置2min，室溫下W1200化/min離 屯、2min;
[0140] (19)取0.化L DNA質粒用紫外分光光度計檢測濃度后，于-20°C或者-80°C冰箱保 存備用。
[0141] 2、轉染用細胞的準備
[0142] (1)用含有10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培養基（購買自Thermo公司）分別培養MDCK 細胞和293T細胞，待細胞長滿單層后，用0.25%的膜酶消化，將細胞吹散后，接入適量細胞 至6孔組織培養板中。
[0143] (2)其中293T+MDCK細胞混合培養組按細胞比率1:1接6孔組織培養板，待細胞密度 長至80%-90%時進行轉染。其中，用作轉染的細胞，其狀態一定要上佳，只有運樣才能提供 充足的酶類供基因轉錄所需。