一種耐熱木聚糖酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及木聚糖酶，具體的說是一種耐熱木聚糖酶及其應用。
【背景技術】
[0002] 半纖維素是植物細胞壁的重要組成部分，是自然界中第二豐富的多糖，其主要組 成是木聚糖。木聚糖成分復雜，主鏈由0-1，4糖巧鍵相連的化喃木糖殘基構成，其側鏈可W 被阿拉伯糖、葡聚糖醒酸、乙酷基團等取代。0-1，4-內切木聚糖酶化11(1〇-護1，4-巧1日11曰36， EC 3.2.1.8)的主要作用是從木聚糖鏈內部隨機切斷β-1，4糖巧鍵，形成不同聚合度的寡聚 木糖。木聚糖酶在自然界中存在廣泛，在細菌、真菌、放線菌、藻類、原生動物等中都有發現。 根據蛋白質氨基酸序列，可W將其分為不同的糖巧水解酶家族，木聚糖酶主要存在于第5、 7、8、10、11和43家族。
[0003] 木聚糖酶具有重要的應用價值，在食品、飼料、制漿造紙、紡織、能源等領域有著巨 大的應用前景。工業用酶要求具有較高的酶活性、良好的熱穩定性和pH穩定性。如在紙漿漂 白中，需要具備耐堿、耐熱和高活性且不具有纖維素酶活性的木聚糖酶。糖巧水解酶11家族 的木聚糖酶不具有纖維素酶活性且分子量小，易于穿透纖維素網絡水解木聚糖，因此，在造 紙工業中應用潛力巨大。工業生產中，木聚糖酶的碳水化合物結合模塊與底物產生不可逆 結合，降低酶的回收利用率。因此，缺少碳水化合物結合模塊的木聚糖酶，可W高效降解高 濃度底物、降低酶的使用成本。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種耐熱木聚糖酶及其應用。
[000引為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:一種耐熱木聚糖酶，耐熱木聚糖酶為
[0006] (a),編碼具有木聚糖酶活性的多膚的核酸，該核酸編碼的蛋白質序列由SEQ ID NO: 2中氨基酸序列所示(TM1);
[0007] (b)，編碼具有木聚糖酶活性的多膚的核酸，其與SEQ ID N0:2中氨基酸序列具有 80% W上同源性的序列；
[0008] 或，（C)，（a)或(b)的核酸所編碼木聚糖酶的缺少信號序列或碳水化合物結合模 塊。
[0009] 所述(C)中缺少信號序列或碳水化合物結合模塊為木聚糖酶XynA的C端碳水化合 物結合模塊缺失或N端氨基酸突變體，其由SEQ ID N0:4中氨基酸所示(TM1-M)。
[0010] 所述TM1或TM1-M在酶解催化或熱穩定性中的應用。
[0011] 重組表達載體為含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和表達載體。
[0012] 所述表達載體為祀 ASY-El、pEASY-E2、祀 T-22b、祀 T28、祀Τ32、ρ犯-30、pGEX-4T-2、 地R322、pUC18或PPIC9K。
[0013] 所述TM1或TM1-M的重組表達載體在酶解催化或熱穩定性中的應用。
[0014] 菌株為含SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列的宿主菌株。
[0015] 所述宿主細胞為大腸桿菌E.coli化21(DE3)。
[0016] 本發明的C端碳水化合物結合模塊缺失后的截短蛋白TM1具有好的催化活性和熱 穩定性。
[0017] 本發明所具有的優點：
[0018] 本發明提供的木聚糖酶性質優良、適合于飼料、食品、制漿造紙工業中。本發明的 木聚糖酶TM巧PTM1-M最適溫度75°C。本發明的截短蛋白TM1相較于全長蛋白XynA，具有更高 的催化效率和更強的熱穩定性，而其最適溫度和最適pH保持不變;將截短蛋白的N端氨基酸 進行突變，獲得木聚糖酶TM1-M，其熱穩定性得到進一步提高。C端碳水化合物結合模塊缺失 蛋白TM1及TM1-M不會產生與底物的不可逆結合，是工業生產用酶制劑的有力候選者。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明實施例提供的重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析圖，其中，Μ為分子量標 準蛋白；1、3為純化的木聚糖酶XynA; 2為純化的木聚糖酶ΤΜ1 ;4為純化的木聚糖酶ΤΜ1-Μ。
[0020] 圖2為本發明實施例提供的重組木聚糖酶酶解1 %木聚糖產物分析圖。其中，Μ為木 糖及木寡糖標準，XI為木糖，Χ2為木二糖，Χ3為木Ξ糖、Χ4為木四糖、Χ5為木五糖;X為75°C處 理1化的木聚糖；1為木聚糖酶XynA酶解木聚糖1化的產物組成;2為木聚糖酶TM1酶解木聚糖 1化的產物組成。
【具體實施方式】
[0021] 實施例在W本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的 操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0022] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。
[0023] 實施例1、木聚糖酶XynA、TMl、TM1-M的獲得及其原核表達載體的構建
[0024] 該基因的克隆過程及其原核表達載體的構建過程包括W下步驟：
[0025] 1、木聚糖酶基因的克隆
[0026] 木聚糖酶XynA基因設計如下引物：
[0027 ] XynA-F:CAAGCAGCCATAACACTCACAT
[0028] XynA-R:TTATTCAATCAACAAATAATCTGCAT
[0029] 木聚糖酶TM1基因設計如下引物：
[0030] TM1-F:CAAGCAGCCATAACACTCACAT [0031 ] TM1-R:CGTTGTAGTTGGCGTAGTTGAA
[0032] 木聚糖酶TM1-M基因設計如下引物：
[0033] TM1-M-F:CAAACCAGCATAACACTCACATCAAATGCAA
[0034] TM1-M-R:CGTTGTAGTTGGCGTAGTTGAA
[00；35] W保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中屯、（China General Microbiological Culture Collection,CGMCC)保藏編號CGMCC 1.5183,保藏日期為2013年3月的解糖熱解纖 維素菌的基因組DNA為模板，分別WXynA-F與XynA-R、TMl-F與TM1-R、TM1-M-F與TM1-M-R為 引物對，通過PCR的方式擴增得到目的基因片段。
[0036] 擴增木聚糖酶XynA的PCR反應體系為50μ1，包括：細菌基因組DNA: 1μ1; 10 X PCR Buffer:5μ1;dNTP Mixture(各2.5mM):化1;引物XynA-F(20μΜ)，化1;引物XynA-R(20μΜ)，化 1;LA Taq polymerase巧υ/μ1): Ο.扣1;加 dd出Ο至總體系為50μ1 JCR擴增條件如下：94°C預 變性 5min; 94°C 變性 30sec，50°C 退火 45sec，72°C 延伸 70sec，循環 30 次;72°C 延伸 lOmin。 [0037] 擴增木聚糖酶TMl的PCR反應體系為50μ1，包括：細菌基因組DNA: 1μ1; 10 X PCR Buffer:5μ1;dNTP Mixture(各2.5mM):化1;引物ΤΜ1-Ρ(20μΜ)，化1;引物ΤΜ1-Κ(20μΜ)，化1; LA Taq polymerase(抓/μ1) :0.5μ1;加 d地2〇至總體系為SOyLPCR擴增條件如下：94°C預變 性 5min; 94°C 變性 30sec，56°C 退火 45sec，72°C 延伸 60sec，循環 30 次;72°C 延伸 lOmin。
[003引擴增木聚糖酶TM1基因序列tml如SEQ ID N0.1所示;SEQ ID N0.1基因序列編碼的 糖巧水解酶11家族的截短蛋白TM1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0039] 擴增木聚糖酶TM1-M的PCR反應體系為50μ1，包括：細菌基因組DNA:lyl;10XPCR Buffer:5yl ;dNTP Mixture(各2.5mM):化1;引物ΤΜ1-Μ-Ρ(20μΜ)，化1;引物ΤΜ1-Μ-Κ(20μΜ)， 化1; LA Taq polymerase(抓/μ1): 0.5μ1;加 d地2〇至總體系為50μ1 JCR擴增條件如下：94°C 預變性 5min; 94°C 變性 30sec，56°C 退火 45sec，72°C 延伸 60sec，循環 30 次;72°C 延伸 lOmin。
[0040] 擴增木聚糖酶TMl-M的截短蛋白TMl的N端第2位、第3位氨基酸分別突變為蘇氨酸 和絲氨酸，該木聚糖酶的基因序列tml-m如SEQ ID NO.3所示;所述SEQ ID NO.3基因序列編 碼的糖巧水解酶11家族的突變體蛋白TM1-M，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0041] 2、木聚糖酶基因表達載體的構建
[0042] 將上述經PCR獲得的基因片段分別連接到表達載體祀ASY-E1中。經PCR和測序鑒定 后將含有木聚糖酶XynA、TMl和TM1-M基因的陽性克隆質粒分別命名為pEASY-El-xynA、 pEASY-E 1 -tml 和祀 ASY-E1 -tml -m。
[0043] SEQ ID NO. 1:
[0044]
[004引 （a)序列特征：
[0046] 參長度：642
[0047] ?類型:基因序列
[004引 ?鏈型:單鏈
[0049] ?拓撲結構:線性
[0050] (b)分子類型:DNA
[00川 （C)假設:否
[005引（d)反義:否
[0053] (e)最初來源:解糖熱解纖維素菌
[0054] 所述SEQ ID NO. 1基因序列編碼的糖巧水解酶11家族的截短蛋白TM1，其氨基酸序 列如沈Q ID NO.2所示。
[0055] SEQ ID NO.2： ?
[0057] (a)序列特征：
[005引參長度:214
[0059] ?類型:氨基酸序列
[0060] 參鏈型:單鏈
[0061] ?拓撲結構:線性
[0062] (b)分子類型：蛋白質 [006引（C)假散否
[0064] (d)反義：否
[0065] (e)最初來源:解糖熱解纖維素菌
[0066] 結構特點：其理論分子量為23.4kDa，40-220為糖巧水解酶11家族結構域。
[0067] 本發明的截短蛋白TM1的N端第2位、第3位氨基酸分別突變為蘇氨酸和絲氨酸，突 變體木聚糖酶TM1-M具有好的熱穩定性。具體地，該木聚糖酶的基因序列tml-m如SEQ ID NO. 3所示。
[006引 SEQ ID NO.3：
[0069]
[0070] (a)序列特征：
[0071] ?長度：642
[0072] ?類型:基因序列
[0073] ?鏈型:單鏈 [0074] ?拓撲結構:線性 [007引 （b)分子類型:DNA
[0076] (C)假設:否
[0077] (d)反義:否
[0078] (e)最初來源:解糖熱解纖維素菌
[0079] 所述SEQ ID NO.3基因序列編碼的糖巧水解酶11家族的突變體蛋白TM1-M，其氨基 酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0080] 沈Q ID NO.4: 「ηπβ?1
[008引 （a)序列特征：
[0083] 參長度:214
[0084] ?類型:氨基酸序列 [0085] ?鏈型：單鏈
[0086] ?拓撲結構:線性
[0087] (b)分子類型：蛋白質 [008引（C)假散否
[0089] (d)反義:否
[0090] (e)最初來源:解糖熱解纖維素菌
[0091] 結構特點：其理論分子量為23.4kDa，40-220為糖巧水解酶11家族結構域。
[0092] 實施例2、木聚糖酶XynA、TMl、TMl-M的表達、純化
[0093] 將實施例1獲得的含有木聚糖酶XynA、TMl和TM1-M基因的原核表達載體祀ASY-E1- 巧nA、pEASY-El-tml和祀ASY-El-tml-m分別轉化大腸桿菌E.coli化21(DE3)，分別挑選陽 性單克隆，將獲得陽性單克隆分別在37°C下搖菌至OD600為0.5后，加入終濃度ImM的IPTG，16 °C下誘導16小時，離屯、收集各自菌體，將分別得到的含有目的蛋白的菌體按Ig菌體加入4ml 憐酸鹽緩沖液巧OmM化出K)4,300mM NaCl，pH 8.0)，同