時加入0.04ml 100X蛋白酶抑制劑， 溶菌酶(終濃度Img/ml)，使各菌體細胞充分懸浮后采用超聲波法破碎細胞。所得細胞破碎 液分別經4°C、10000 X g離屯、20min，所得各自的上清經0.22WI1濾膜過濾后即為各自菌體的 粗酶液。
[0094] 進行蛋白純化，具體方法為:Ni-NTA-Sef inose柱中的乙醇流出后，加入總體積為 10ml的無菌水，每次加入2ml。加入總體積10ml的憐酸鹽緩沖液(50mM Na此K)4,300mM化C1， pH8.0)，每次加入2ml。加入粗酶液，并穿透3次。加入憐酸緩沖液（50mM化出P〇4，300mM 化Cl，p冊.0)，直至流出液中無蛋白。然后依次加入咪挫濃度逐漸升高的洗脫緩沖液(50mM Na出P〇4，300mM NaCl，咪挫濃度分別為25mM、50mM、lOOmM、250mM，pH 8.0)各5mL，并收集蛋白 組分，每次收集ImL。將木聚糖酶XynA、TM巧日TMl-M的洗脫液分別使用lOkDa超濾管置換PC緩 沖液(PC緩沖液，50mM憐酸，12mM巧樣酸，pH 6.5)，W去除酶液中的咪挫，分別獲得木聚糖酶 XynA、TMl和TM1-M酶液。將上述純化得到的重組蛋白質溶液進行SDS-PAGE電泳，純化結果如 圖1所示，所獲得的木聚糖酶XynA分子量為36.4kDa，截短蛋白TM1分子量為23.4kDa，突變體 蛋白TM1-M分子量為23.4kDa。
[009引實施例3、酶學特性檢測
[0096]將上述方法獲得的木聚糖酶XynA、TMl和TMl-M，分別進行下述反應進行酶學特性 鑒定：
[0097] 1、木聚糖酶的比酶活的測定
[0098] 利用上述純化的重組木聚糖酶，進行下述反應：
[0099] 將上述獲得的濃度為0.祉g/ml的木聚糖酶XynA溶液、0.4μg/ml的截短蛋白TM1溶 液和0.化g/ml的突變體蛋白TM1-M溶液各取50μ1，分別加入到10化1 1 %的木聚糖溶液中， 其中木聚糖溶于PC緩沖液(PC緩沖液為50mM憐酸，12mM巧樣酸，pH 6.5)，在75°C下反應10分 鐘。使用3.5-二硝基水楊酸(DNS)法測定反應結束后還原糖的生成量。
[0100] 上述反應結束后加入20化1 DNS溶液，煮沸5分鐘，冷卻后加入65化1水并混勻，取 200μ1 加入到酶標板中，測其在 540nm 的吸收值。W0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、 0.9、lmg/ml的木糖溶液為標準樣品，WDNS法測得的吸光度值與糖濃度繪制標準曲線，根據 標準曲線計算所得樣品還原糖的量。
[0101] 木糖標準曲線：y = 11.406X-0.0049 r2 = 0.9987
[0102] 其中，X為木糖濃度，mg/ml ;y為對應糖濃度下的540nm的吸收值。
[0103] 一個酶活單位定義為每分鐘水解底物產生化mol還原糖所需的酶量。比酶活力定 義為酶活與對應蛋白量的比值。酶活反應體系如表1所示。
[0104] 表1酶活反應體系
[0105]
[0106] 根據上述實施方式，如表2所示，木聚糖酶XynA、TMl和TM1-M的比酶活分別為2601、 922U5451U/mg〇
[0107] 2、木聚糖酶的最適反應溫度、最適反應pH的測定
[010引將實施例2純化的重組木聚糖酶在不同抑范圍（pH 4.5、5、5.5為200mM的乙酸-乙 酸鋼緩沖液;pH 6、6.5、7、7.5、8為PC緩沖液(50mM憐酸，12mM巧樣酸））中進行酶促反應，測 定其最適反應抑。結果表明，重組蛋白XynA和TM1的最適抑均為6.5，突變體蛋白TM1-M的最 適抑為5.6(表2)。木聚糖酶在其最適反應抑值條件下測其在不同溫度范圍（55、60、65、70、 75、80°C)的比酶活，確定其最適反應溫度。結果如表2所示，重組蛋白XynA、TM1和TM1-M的最 適反應溫度均為75°C。
[0109] 3、木聚糖酶的半衰期測定
[0110] 木聚糖酶XynA、TMl和TM1-M分別置于65、75、85°0，每隔一段時間取出適量蛋白溶 液，在75°C下測定殘余酶活，殘余酶活為50%時的取樣時間即為此條件下的半衰期（ti/2)。 結果表明，在75°C時，木聚糖酶XynA、TMl和TM1-M的半衰期分別為5.化、4化和70h(表2)。
[0111] 表2木聚糖酶XynA、TMl和TM1-M的酶學特性分析
[0112]
[0113] 4、重組木聚糖酶的產物分析
[0114] W抑6.5的1%木聚糖為底物，分別加入上述純化酶XynA和TM1，75°C反應12h。薄 層層析分析其產物組成，W木糖、木二糖、木Ξ糖、木四糖和木五糖作為標準。結果表明，木 聚糖酶XynA和TM1酶解木聚糖的產物組成為木二糖、木Ξ糖、木四糖和木五糖(圖2)。
[0115] 實施例4、木聚糖酶XynA和TM1的畢赤酵母表達載體的構建和蛋白純化
[0116] W祀ASY-El-xynA作為模板，PCR擴增獲取進行畢赤酵母表達載體構建所需的xynA 基因，同時擴增獲得祀ASY-E1載體所帶的6 X組氨酸標簽。具體的，引物設計如下：
[0117] pPIC9K-XynA-F：
[0118] AGAGAGGCTGAAGCTTACATACATATGCGGGGTTCTCATCAT
[0119] pPIC9K-XynA-R：
[0120] GTCATGTCTAAGGCGAATTATTCAATCAACAAATAATCTGCATA
[0121] 擴增木聚糖酶XynA的PCR反應體系為50μ1，包括：已構建的祀ASY-El-巧nA載體：1μ 1; 10 X PCR Buf f er:扣1; dNTP Mixture (各2.5mM):化1;引物pPIC9K-XynA-F( 20μΜ)，化1;引 物pPIC9K-XynA-R(20μΜ)，化1;LA Taq ροlymerase(抓/μ1):0.5μ1;加 d地2〇至總體系為50μ 1 cPCR擴增條件如下:94°C預變性Imin; 94°C變性30sec，55°C退火40sec，72°C延伸90sec，循 環30次;72°C延伸5min。
[0122] W祀ASY-El-tml作為模板，PCR擴增獲取進行畢赤酵母表達載體構建所需的tml基 因，同時擴增獲得祀ASY-E1載體所帶的6 X組氨酸標簽。具體的，引物設計如下：
[0123] PPIC9K-TM1-F：
[0124] AGAGAGGCTGAAGCTTACATACATATGCGGGGTTCTCATCAT
[0125] PPIC9K-TM1-R：
[0126] GTCATGTCTAAGGCGAATTACGTTGTAGTTGGCGTAGTTGAACCACT
[0127] 擴增木聚糖酶TM1的PCR反應體系為50μ1，包括：已構建的祀ASY-El-tml載體：1μ1; 10 X PCR Buff er: 5μ1; dNTP Mixture(各2.5mM):化1;引物pPIC9K-TMl-F(20yM)，化1;引物 pPIC9K-TMl-R( 20μΜ)，化1; LA Taq polymerase (抓/μ1): 0.5μ1;加 d地2〇至總體系為 50μ1。 PCR擴增條件如下:94°C預變性Imin; 94°C變性30sec，55°C退火40sec，72°C延伸60sec，循環 30 次;72°C 延伸 5min。
[0128] 通過PCR擴增在表達載體PPIC9K上引入上述擴增片段巧nA、tml的重疊區域15bp堿 基。具體的，引物設計如下：
[0129] PPIC9K-F：
[0130] TAATTCGCCTTAGACATGACTGTTCC
[0131] PPIC9K-R：
[0132] GTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCGAG
[0133] 具體的，PCR反應體系為50μ1，包括:PPIC9K載體：1μ1; 10 X PCR Buf f er: 5μ1; dNTP Mixture(各2.5mM) :4μ1;引物pPIC9K-F(20yM)，1μ1;引物pPIC9K-R(20yM)，1μ1 ;LA Taq polymerase巧υ/μ1): 0.扣1;加 dd出0至總體系為50μ1 JCR擴增條件如下：94°C預變性Imin; 94°C 變性 30sec，55°C 退火 Isec，72°C 延伸 7min，循環 20 次;72°C 延伸 8min。
[0134] 通過Gibson連接的方法，將木聚糖酶XynA和TMl的擴增片段分別與含有重疊區域 的酵母表達載體PPIC9K的擴增片段連接。具體的，G化son連接體系為15μ1，包括Gibson溶液 7.扣1;木聚糖酶XynA或TM1的擴增片段化1 ;pPIC9K的擴增片段化1，加 d地2〇至總體系為15μ 1。上述體系置于50°C連接化，得到含有目的片段的重組載體。
[0135] 將含有木聚糖酶XynA的重組載體pPIC9K-xynA和含有木聚糖酶TM1的重組載體 pPIC9K-tml分別轉化畢赤酵母GS115,獲得重組畢赤酵母菌株。
[0136] 分別取含有上述重組質粒的GS115菌株，接種于300ml BMGY培養基中，30°C 200巧m培養4她后，添加1 %甲醇繼續誘導表達24h，離屯、收集上清。經蛋白定量和比酶活測 定，結果顯示，木聚糖酶XynA的蛋白表達量為507mg/L，比酶活為1867U/mL，經Ni-NTA- Sefinose柱純化所得蛋白比酶活為2823U/mg;木聚糖酶TM1的蛋白表達量為923mg/L，比酶 活為3709U/mL，經Ni-NTA-Sef inose柱純化所得蛋白比酶活為862抓/mg。
【主權項】
1. 一種耐熱木聚糖酶，其特征在于:耐熱木聚糖酶為 (a) ，編碼具有木聚糖酶活性的多肽的核酸，該核酸編碼的蛋白質序列由SEQ ID N0:2 中氨基酸序列所示(TM1); (b) ，編碼具有木聚糖酶活性的多肽的核酸，其與SEQ ID N0:2中氨基酸序列具有80% 以上同源性的序列； 或，（c)，（a)或(b)的核酸所編碼木聚糖酶的缺少信號序列或碳水化合物結合模塊。2. 按權利要求1所述的耐熱木聚糖酶，其特征在于:所述(c)中缺少信號序列或碳水化 合物結合模塊為木聚糖酶XynA的C端碳水化合物結合模塊缺失或N端氨基酸突變體，其由 SEQ ID從):4中氨基酸所示（了]?1-]\〇。3. -種耐熱木聚糖酶的應用，其特征在于:所述TM1或TM1-M在酶解催化或熱穩定性中 的應用。4. 一種含耐熱木聚糖酶的重組表達載體，其特征在于:重組表達載體為含SEQ ID NO:2 或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列和表達載體。5. 按權利要求4所述的含耐熱木聚糖酶的重組表達載體，其特征在于:所述表達載體為 pEASY-El、pEASY-E2、pET-22b、pET28、pET32、pQE-30、pGEX-4T-2、pBR322、pUCl8或pPIC9K。6. -種含耐熱木聚糖酶的重組表達載體的應用，其特征在于:所述TM1或TM1-M的重組 表達載體在酶解催化或熱穩定性中的應用。7. -種含耐熱木聚糖酶的宿主菌株，其特征在于:菌株為含SEQ ID N0:2或SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的宿主菌株。8. 按權利要求7所述的含耐熱木聚糖酶的重組表達載體，其特征在于:所述宿主細胞為 大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。
【專利摘要】本發明涉及木聚糖酶，具體的說是一種耐熱木聚糖酶及其應用。(a)，編碼具有木聚糖酶活性的多肽的核酸，該核酸編碼的蛋白質序列由SEQ？ID？NO：2中氨基酸序列所示(TM1)；(b)，編碼具有木聚糖酶活性的多肽的核酸，其與SEQ？ID？NO：2中氨基酸序列具有80％以上同源性的序列；或，(c)，(a)或(b)的核酸所編碼木聚糖酶的缺少信號序列或碳水化合物結合模塊。本發明所示木聚糖酶TM1和TM1-M將在飼料、食品和制漿造紙工業的應用中顯示出巨大的潛在價值。CGMCC 1.518320130322
【IPC分類】C12N15/70, C12R1/19, C12N1/21, C12N9/42
【公開號】CN105671019
【申請號】
【發明人】李福利, 孟冬冬, 呂明, 張坤迪
【申請人】中國科學院青島生物能源與過程研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年12月4日