高活性纖維二糖水解酶的制備方法及高活性纖維二糖水解酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物煉制化iorefinery)的糖化酶。特別是設及提高了活性的纖維二 糖水解酶的制備方法W及具有高活性的纖維二糖水解酶。
【背景技術】
[0002] 通過基因重組技術，能夠進行各種各樣的蛋白質改性。針對酶也進行了提高活性、 增加表達量等增強酶活性的嘗試。采取如下手法作為提高酶活性的手法：改變氨基酸，向酶 與底物結合的活性中屯、的氨基酸導入變異，從中選擇高活性的酶。
[0003] 酶的底物結合部位在大多數情況下被比作鑰匙-鎖狀。另一方面，人們已知在對 纖維素等高分子底物起作用的酶當中，雖然僅限于極少部分的酶，但它們為具有高分子底 物嵌入的隧道狀或溝狀的相對較長的底物結合部位的酶。
[0004] 從端部切斷纖維素鏈的酶、即外切葡聚糖酶的反應產物是纖維二糖，也被稱為纖 維二糖水解酶。纖維二糖水解酶的活性中屯、形成如上所述的隧道狀，通過酶反應而被切斷 的纖維二糖從隧道的相反一側出來，因此，酶反應持續進行，而纖維二糖水解酶不會從纖維 素鏈脫離。
[0005] 至今為止一直在進行提高纖維二糖水解酶的酶活性的嘗試，并已經報道了幾種變 異體。例如，籃狀菌燈alaromyces)相關的變異體（參照美國專利第8790894號說明書）、 來源于革菌（Phanerochaete)的纖維二糖水解酶的變異體相關的變異體（參照日本專利公 開公報特開2010-046034號公報）等。
【發明內容】
[0006] 然而，在生物煉制領域中需要一種更高效的酶，而在現有技術中活性提高的效果 并不充分。因此，有必要制備一種活性更高的纖維二糖水解酶變異體。
[0007] 更進一步，像纖維二糖水解酶那樣，在保持高分子底物的同時進行催化反應的進 行性酶（processive enzyme)在大范圍上存在的部位構成底物結合部位，因此，還大量存在 其效果沒有得到研究的氨基酸。因此，本發明的課題在于對未被研究的氨基酸部位的置換 效果進行調查，獲取一種具備較高活性的纖維二糖水解酶。
[0008] 本發明的制備提高了活性的纖維二糖水解酶的方法的特征在于：將作為從序列號 1所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天口冬酷胺、或者在與所述纖維二糖水 解酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對應于該位置的天口冬酷置換為丙 氨酸。
[0009] 使用作為確定影響蛋白質功能的部位的一方法的丙氨酸掃描 (Alanine-scanning)進行解析后發現：通過將作為由序列號1所示的纖維二糖水解酶的第 62位氨基酸的天口冬酷胺置換為丙氨酸，能夠獲得一種具備高活性的纖維二糖水解酶。該 氨基酸殘基位于纖維二糖水解酶的隧道結構內。
[0010] 因此，可W推測只要是與由序列號1所示的纖維二糖水解酶具有同源性的纖維二 糖水解酶，通過將與該位置對應的位置的天口冬酷胺置換為丙氨酸，同樣能夠獲得高活性 的纖維二糖水解酶。
[0011] 另外，本發明的提高了活性的纖維二糖水解酶的特征在于具備下述變異：將作為 從序列號1所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天口冬酷胺、或者在與所述纖 維二糖水解酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對應于該位置的天口冬酷 置換為丙氨酸。
[0012] 將序列號1所示的序列的第62位的天口冬酷胺置換為丙氨酸后的纖維二糖水解 酶具有高活性。因此，通過將第62位的天口冬酷胺或者對應于該位置的天口冬酷胺置換為 丙氨酸后的變異體、或者除了包括該置換還進一步組合已知酶活性增強的氨基酸置換，能 夠獲得活性更高的纖維二糖水解酶。
[0013] 本發明的提高了活性的纖維二糖水解酶的特征在于，其序列由序列號2所示。由 序列號2所示的纖維二糖水解酶與野生型酶相比具有12倍的比活。
【附圖說明】
[0014] 圖1為示意性地表示纖維二糖水解酶的立體結構W及表示各氨基酸殘基（amino acid residue)位置的圖。
[0015] 圖2為表示利用丙氨酸掃描（alanine scanning)獲得的纖維二糖水解酶變異體 相對野生型的相對活性比的圖。
[0016] 圖3為表示通過置換了從N末端起第62位的氨基酸后相對野生型的相對活性比 的圖。
【具體實施方式】
[0017] 人們已知纖維二糖水解酶的晶體結構。纖維二糖水解酶與作為底物的纖維素相互 作用的部位受長環（loop)包圍，因而被稱為隧道結構。與纖維素結合并發生分解反應的活 性中屯、位于隧道結構內部。所W，可W認為通過獲得隧道結構內的氨基酸具有變異的酶，就 能夠獲得高活性變異體。
[0018] 然而，由于隧道結構跨越了大范圍，要對與底物結合并影響活性的氨基酸都進行 解析是比較困難的。因此，基于立體結構，選擇預測存在于隧道結構內、并且對相對作為 底物的纖維素的移動構成障礙從而影響活性的可能性較高的氨基酸，通過丙氨酸掃描進 行解析。首先，為了導入變異，分離纖維二糖水解酶基因，構建通過米曲霉（Aspergillus cxryzae)表達的載體。
[0019] (1)構建通過米曲霉表達纖維二糖水解酶的載體（vector)(提取纖維頂抱霉 (Acremonium cellulolyticus)的基因組DNA)將纖維頂抱霉的H1 菌株（陽RM BP-11508, W 下簡稱"化菌株"）接種到PDB瓊脂培養基（在PDA培養基度D Difco公司制，PDA broth) 中添加了 1.5% (質量/體積）的瓊脂糖（agarose)的平板培養基）上，在30°C下培養一 周。將得到的菌體W每個瓊脂直徑5mm為單位進行切取，并接種于PDA培養基中，W 30°C 下、130巧m進行搖瓶培養（shaking culUire)。W 15000巧m對培養物進行10分鐘離屯、分 離處理，由此回收菌體。更進一步，通過PDA培養基重復清洗回收的菌體兩次，從而獲取菌 體試樣。
[0020] 在裝入有該菌體的2mL容量的塑料試管中加入研磨珠，利用臺式珠磨粉碎機 (Shake master,生物科學社制）實施90秒的粉碎處理Ξ次，將菌體試樣磨成粉末狀后，使 用 Nucleon (Amersham 公司制）提取 DNA。
[0021] (纖維頂抱霉的野生型纖維二糖水解酶的DNA克隆）
[0022] 將獲得的基因組作為模板，使用序列號3、4(參照下述表1)所示的引物 (primer) 1、2,通過PCR擴增編碼野生型的纖維二糖水解酶的序列。使用K0D-plus(東洋紡 公司制備）作為DNA聚合酶值NA polymerase)，PCR通過W下方式進行，W 94°C、2分鐘進 行1個循環后，W 96°C、20秒，接著60°C、30秒，進一步72°C、5分鐘進行30個循環。得到 的 PCR 產物利用 QIA 快速 PCR 產物純化試劑盒（QIAquick PCR purification kit, QIAGEN 公司制備）進行提純。得到的纖維頂抱霉的野生型纖維二糖水解酶的氨基酸序列示于序列 號1。
[0023] (地R-enoAP-agdAT-niaD 的制備）
[0024] 在作為大腸桿菌質粒化col i plasmid)的地R322中整合來源于米曲霉 Aspergillus oryzae的硝酸還原酶基因 niaD、來源于米曲霉的agdA基因的終止區 (terminator region) W及來源于米曲霉的enoA基因的啟動區（promoter region),制成 載體地R-enoAP-agdAT-niaD。通過表達硝酸還原酶基因 niaD，能夠選擇導入了使得即使在 硝酸存在的情況下米曲霉也能夠增殖的質粒（plasmid)的菌。W下簡述制備方法。
[00巧]首先，構建整合了來源于米曲霉Aspergillus oryzae的硝酸還原酶基因 niaD基 因的質粒。通過獨立行政法人制品評價技術基盤機構（N口巧獲取米曲霉Aspergillus oryzae RIB40菌株（NBRC號：100959, W下稱為"RIB40菌株"）。W RIB40菌株的基因組 DNA為模板，使用序列號5、6所示的引物3、4,通過PCR對硝酸還原酶基因 niaD的DNA進行 擴增。
[0026] 通過Aval及Ndel對擴增后的niaD的DNA進行消化，提純后，將其插入到地R322 的Aval、Ndel位點，構建地R-niaD。
[0027] 接著，來源于米曲霉的agdA基因的終止區整合到地R-niaD中。
[002引 W RIB40菌株的基因組DNA為模板，使用序列號7、8所示的引物5、6,通過PCR對 來源于米曲霉的agdA基因的終止區下有時還稱為"agdA終止子"）的DNA進行擴增。
[0029] 使用限制酶Sail及Aval消化得到的PCR擴增產物，并將其插入到地R-niaD的 Sail、Aval 位點，得到地R-agdAT-niaD 質粒。
[0030] 接著，將來源于米曲霉的enoA基因的啟動區整合到所得到的地R-agdAT-niaD中。
[0031] W RIB40菌株的基因組DNA為模板，使用序列號9、10所示的引物7、8，進行PCR，對 來源于米曲霉的enoA基因的啟動區（W下有時還稱為"enoA啟動子"）的DNA進行擴增。 [003引使用限制酶化el及Sail消化得到的PCR擴增產物，并將其插入到 地R-agdAT-niaD 的 Miel、Sail 位點，得到地R-enoAP-agdAT-agdAT-niaD 質粒。
[0033] [表 1]
[0034]
[0036] (野生型纖維二糖水解酶DM向地R-enoAP-agdAT-niaD的整合）
[0037] 使用限制酶 Smal 消化地R-enoAP-agdAT-niaD，獲得地R-enoAP-agdAT-niaD 的 Smal處理片段。
[0038] 使用In-Fusion(注冊商標）皿克隆試劑盒（Clontech公司制）將編碼野生型纖 維二糖水解酶的序列克隆到該Smal處理片段上，獲得地R-enoAP-CBH-agdAT-niaD(CBH米 曲霉表達用載體）
[0039] (變異型纖維二糖水解酶DNA向地R-enoAP-agdAT-niaD的整合）
[0040] 對于變異型纖維二糖水解酶，通過PCR制備纖維二糖水解酶基因的從5' -側到變 異位點W及從變異位點到基因3' -側的兩個片段。通過將所得到的兩個片段的DNA整合 到地R-enoAP-agdAT-niaD中來進行構建。此時，由于包含變異位點的引物被設計成能夠進 行退火（annealing)，變異型纖維二糖水解酶基因除了在整合到地R-enoAP-agdAT-niaD中 時包含變異位點之外，具有從5' -側到3' -側與野生型纖維二糖水解酶相同的氨基酸序 列，并處于相連狀態。
[00川 實施例
[004引（實施例1)
[0043] (丙氨酸置換變異體的制作）
[0044] W纖維頂抱霉的纖維二糖水解酶的立體結構為基礎，將位于具備由序列號1所示 的氨基酸序列的、來源于頂抱霉屬（Acremonium)的纖維二糖水解酶的隧道結構內的30處 的氨基酸置換為丙氨酸，解析其活性，選擇酶活性提高的位點。在30處的置換中，有6處與 野生型纖維二糖水解酶相比活性有所提高。
[0045] 通過丙氨酸置換，活性略