有提高的有：序列號1所示的氨基酸的第203位的賴氨酸 (lysine)化）、第62位的天口冬酷胺（asparagine)(腳、第125位的天口冬酷胺、第201位 的天口冬氨酸值）、第289位的精氨酸（arginine)(時W及第281位的天口冬氨酸（各變 異體根據置換了的氨基酸及其位置有時還分別表示成K203A、N062A、N125A、D201A、R289A、 D281A)ο
[0046] 圖 1 中示出了通過PDB(ht1:p://www. rcsb. org/pdb/home/home. do)獲取的纖維頂 抱霉的纖維二糖水解酶的立體結構W及因丙氨酸置換而使得活性提高的上述氨基酸的位 置。在隧道結構的整個長度上具有通過丙氨酸置換提高活性的位點。
[0047] 針對上述6個變異體，將制作時用到的引物表示到下表2中。使用所述纖維二糖 水解酶的克隆中用到的引物1與引物9~14, W及引物15~20與纖維二糖水解酶的克隆 中用到的引物2分別作為各個引物組，其余的W與野生型纖維二糖水解酶的基因組DNA的 擴增相同的方式進行PCR。
[004引[表 2]
[0049]
[0050]
[0051] (導入了野生型及變異型纖維二糖水解酶米曲霉表達用載體的米曲霉轉化體的制 作）
[0052] 通過特定的方法陽G-巧法（Mol. Gen. Genet. , vol. 218, P. 99 ~104 (1989 年））， 使用整合了上述野生型纖維二糖水解酶的地R-enoAP-agdAT-niaD質粒或者導入了變異的 質粒，對300棵米曲霉Aspergillus oryzae niaD菌株（從獨立行政法人酒類綜合研究所 獲取的niaD缺陷型菌株）進行轉化。通過對用察氏（Czapek-Dox)培養基（其中，糊精 (dextrin)3% (質量/體積）；憐酸氨二鐘0. 1% (質量/體積）；硫酸儀0.05% (質量/ 體積）；硫酸鐵0.001% (質量/體積）；硝酸鋼0.3% (質量/體積））選擇能夠進行增殖 的菌株，獲得轉化體（野生型及變異型纖維二糖水解酶米曲霉轉化體）。
[0053] (纖維二糖水解酶的制備）
[0054] 使制作的纖維二糖水解酶米曲霉轉化株在察氏培養基中形成抱子，并用滅菌水回 收抱子。在裝入500mL容量錐形瓶中的lOOmL的PD液體培養基（其中，糊精2% (質量/體 積）；多聚蛋白腺（polyp巧tone)l% (質量/體積）；酪蛋白氨基酸（casamino acid)0. 1% (質量/體積）；憐酸氨二鐘0. 5% (質量/體積）；硫酸儀0. 05% (質量/體積）；硝酸鋼 0. 1% (質量/體積））中進行接種，使得最終抱子濃度成為IXlOYmL。在30°C下進行液體 培養Ξ天，使培養基中分泌表達纖維二糖水解酶或具有氨基酸變異的纖維二糖水解酶。并 將培養后的該培養液作為酶試樣。該酶試樣通過SDS-PA(iE解析進行確認，并進行蛋白質定 量。
[00巧](纖維素分解活性的測定）
[0056] 使用微晶纖維素（默克公司（Merck KGaA)制備）作為反應底物。另外，根據用 200mM醋酸緩沖液（acetic acid buffer solution)適當稀釋10mM(mmol/L)葡萄糖溶液配 制而成的四點稀釋組（4-point dilution se;ries，0. 5~5. OmM)的測定值，制成標準曲線。
[0057] 首先，在1. 5血容量的塑料試管中加入40 μ L的200mM醋酸緩沖液（抑5. 5)和 50 μ L懸濁于200mM醋酸緩沖液的4% (質量/體積）微晶纖維素懸濁液，充分混合后，調 整到50°C。
[0058] 接著，將 10 μ L 野生型或各變異型化203A、N062A、N125A、D201A、R289A、D281A) 纖維二糖水解酶水溶液添加到各試管中，開始酶反應。在反應開始經過一個小時后，添 加混合100 μ L的DNSA溶液（其中，氨氧化鋼1. 6 % (質量/體積）；3, 5-二硝基水楊 酸（3, S-Dinitrosalixylic acid)0. 5% (質量 / 體積）；四水合酒石酸鋼鐘（Potassium sodium tartrate tetr址y化ate) 30% (質量/體積）），從而停止反應。在反應停止后，進 行離屯、分離（15, 000 X g，5分鐘），在100°C下，煮沸上清液（supernatant) 5分鐘，然后在冰 中冷卻。然后，從各試管中分取100 μ L的反應液，并用100 μ L的蒸饋水稀釋，再測定稀釋 后的溶液在540nm的吸光度（As4。)。采用添加20mM醋酸緩沖液來取代酶試樣并進行相同處 理的試樣作為空白對照化lank)。根據As4。的測定值和標準曲線計算出葡萄糖濃度，該濃度 除W通過蛋白質定量獲得的酶濃度，算得酶單位重量的纖維素分解活性值。結果示于圖2。
[0059] 圖2中示出了與野生型（WT)相比活性提高了的變異體K203A、N062A、N125A、 D201A、R289A、D281A的結果。特別是將第62位的天口冬酷胺（腳置換為丙氨酸（A)的變 異體N062A相對野生型的纖維二糖水解酶具有14倍的比活（specific activity)。其與現 有技術中公開的纖維二糖水解酶變異體相比，也是顯著高的活性。
[0060] (實施例。
[0061] 由于將第62位的天口冬酷胺（腳置換為丙氨酸（A)的變異體N062A與野生型的 纖維二糖水解酶相比活性提高，將第62位的氨基酸置換為疏水性、酸性、堿性等性質不同 的氨基酸，并測定了其活性。
[0062] 制作中用到的引物示于下表3中。使用所述纖維二糖水解酶的克隆中用到的引物 1與引物21~27、W及引物28~34與纖維二糖水解酶的克隆中用到的引物2分別作為各 個引物組，其余的W與野生型纖維二糖水解酶的基因組DNA的擴增相同的方式進行PCR。
[0063][表 3]
[00。
腳)6引在構建質粒后，W與實施例1相同的方式得到纖維二糖水解酶米曲霉轉化株，并 得到變異體酶，測定玉米賴桿（corn stover)分解活性。
[0066] (玉米賴桿分解活性的測定）
[0067] 在將作為木質纖維素類生物質的稻桿細微粉碎后的物質中，W質量比成為1:10 的方式混合2.5% (質量/質量）的硫酸水溶液，在150°C的溫度下維持10分鐘，進行糖化 預處理后，使用氨氧化鋼水溶液將抑值調節到5. 8,在50°C下干燥一天。然后，將用柳頭細 微粉碎后的物質作為活性測定的反應底物使用。
[006引活性測定通過W下方式進行：在1. 5血容量的塑料試管中加入80 μ L的200mM醋 酸緩沖液（P冊.5)和100 μ L懸濁于200mM醋酸緩沖液的4% (質量/體積）玉米賴桿懸濁 液，充分混合后，調整到50°C。
[0069] 接著，添加20 μ L的野生型或各變異型纖維二糖水解酶水溶液，開始酶反應，并在 反應開始經過一小時后，在15, 000Xg、4°C下進行5分鐘離屯、分離處理。將獲得的上清液移 至新的1. 5mL容量的塑料試管，在95°C下熱處理5分鐘后，在15, 000Xg、4°C下進行5分鐘 離屯、分離處理。將獲得的上清液移至新的1. 5血體積的塑料試管后，用0. 2 μm(13mm盤式） 的過濾器過濾。將0. 2mL的濾液移至小瓶（vial)中，進行HPLC測定，對纖維二糖進行檢 巧。。使用和光純藥公司制的纖維二糖作為標準物質，進行糖濃度的評價。HPLC測定中使用 Waters2695 (Waters 公司制造）作為分離器（separator)，使用 Waters2414 (Waters 公司制 造）作為RI檢測器，使用Bio-rad HPX-87H (Bio-Rad公司制造）作為分析柱（Column)。使 用超純水作為洗脫劑，并按照W下條件進行測定：流速為0. 6mL/分鐘；分析柱溫度為80°C; 檢測器溫度為40°C。測定結果示于圖3。
[0070] 與野生型（天口冬酷胺（腳）相比，所發現的活性有所提高的是丙氨酸（A)、谷氨酷 胺（glutamine,曲及組氨酸（histidine, H)。在丙氨酸的情況下，使用玉米賴桿代替底物 測定糖化時，與野生型（腳相比具有12倍W上的比活。
[0071] 而置換為下述各種性質的氨基酸時則沒有超過丙氨酸置換所獲得的活性提高程 度的氨基酸：疏水性氨基酸（色氨酸（trypto地an) (W)、鄉氨酸（valine, V))、中性氨基酸 (絲氨酸（serine,巧、谷氨酷胺怕)）、酸性氨基酸（谷氨酸（glutamic acid,巧）、堿性氨基 酸（basic amino acid)(賴氨酸化）、組氨酸做）。
[0072] 可W推測通過丙氨酸置換而使得活性提高的理由是，隧道結構內的纖維素移動時 的空間位阻被消除。除了將第62位的天口冬酷胺置換為丙氨酸之外，所發現的在本發明中 提高活性的其他變異、例如通過將第203位的賴氨酸或第289位的精氨酸同時置換為丙氨 酸，有望獲得具有更高活性的變異體。
[0073] 如實施例1及實施例2所示，將記載于序列號2的第62位的天口冬酷胺置換為丙 氨酸的纖維二糖水解酶變異體與野生型纖維二糖水解酶相比具有較高的活性。
[0074] 纖維二糖水解酶是被分類于糖巧水解酶（glycoside hy化olases)GH7家族的酶。 在屬于GH7的酶中，位于隧道結構的氨基酸跨越種類而被很好地保存。實際上，在里氏木霉 (Trichoderma reesei)、黃抱原毛平革菌（Phanerochaete C虹ysosporium)中，在對應于序 列號1的第62位的位置的氨基酸為天口冬酷胺。所W，不僅是由序列號1所示的纖維二糖 水解酶，通過將在同源的氨基酸序列中處于該位置的天口冬酷胺置換為丙氨酸，也有望獲 得提高了活性的酶。
[00巧]另外，隧道結構是跨越種類而被保存，因此通過同時導入所報道的纖維二糖水解 酶活性得到提高的其他氨基酸變異，能夠期待活性的進一步提高。
【主權項】
1. 一種提高了活性的纖維二糖水解酶的制備方法，其特征在于， 將作為從序列號1所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天門冬酰胺、或者 在與所述纖維二糖水解酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對應于該位置 的天門冬酰胺置換為丙氨酸。2. -種提高了活性的纖維二糖水解酶，其特征在于，具備下述變異：將作為從序列號1 所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天門冬酰胺、或者在與所述纖維二糖水解 酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對應于該位置的天門冬酰置換為丙氨 酸。3. 根據權利要求2所述的提高了活性的纖維二糖水解酶，其特征在于，所述纖維二糖 水解酶的序列由序列號2表示。
【專利摘要】本發明的課題在于提供一種高活性的纖維二糖水解酶。通過將作為從序列號1所示纖維二糖水解酶的N末端起第62位氨基酸的天門冬酰胺、或者在與所述纖維二糖水解酶具有同源性的纖維二糖水解酶的氨基酸序列中的對應于該位置的天門冬酰置換為丙氨酸，可以提高纖維二糖水解酶的活性。
【IPC分類】C12N9/42
【公開號】CN105671020
【申請號】
【發明人】光澤茂信, 木村敬一, 田中麻衣子, 新川智
【申請人】本田技研工業株式會社
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年12月4日