一種構建微生物共培養體系產細菌纖維素的方法
【技術領域】
[0001]本發明是通過構建木醋桿菌Acetobacter xylinum NUST4.2 (簡稱Ax.4.2)和衣藻(Chlamydomonas)共培養體系，提高細菌纖維素的產率，并實現對纖維素微納米尺度組裝過程進行精密調控，具體涉及微生物共培養體系的構建。
【背景技術】
[0002]細菌纖維素(BacterialCellulose, BC)是由木醋桿菌(Acetobacter xy linum)生物合成的一種新型高性能微生物合成材料，與其他形式形成的纖維素相比，盡管具有相同的化學成分，但其還具有特殊的物理化學和生物學特性，特別是發酵過程的可調控發酵底物的多樣性、微生物的多樣性等。
[0003]作為一種新興的生物功能材料，細菌纖維素的生產雖然已實現工業化。但迄今為止，在細菌纖維素的工業化生產過程中依然存在很多問題亟待解決，這些問題的存在也嚴重阻礙了細菌纖維素作為優良生物材料的廣泛使用。其中，最嚴峻的工藝難題是在發酵后期，細胞會向環境中分泌一種水溶性多糖，acetan。這種物質會使發酵液粘度增加。Acetobacter xyIinum是一種嚴格的好氧菌，常用于細菌纖維素的制備，在制備過程發酵液中acetan的累積，不僅影響了細胞對氧氣的攝取，使胞內代謝反應減緩，同時作為主要的副產物，消耗了底物，使目標產物的產率下降，不利于工業化生產。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供了一種構建微生物共培養體系產細菌纖維素的方法。該方法通過利用木醋桿菌在發酵過程中會分泌乙酸，衣藻是以乙酸為碳源的微生物，能消耗發酵液中的乙酸，使環境pH維持在適宜的水平，兩種微生物共培養能實現互利共生，解決了發酵后期粘度過高造成的溶氧問題，同時能維持發酵過程中PH穩定，提高了細菌纖維素的產率，產率從3.67g/L提高至IJ 5.21g/L0
[0005]實現本發明目的的技術解決方案為:
[0006]第一步:木醋桿菌與衣藻分別進行種子培養；
[0007]第二步:將衣藻種子液經離心濃縮后，通過控制微流控技術，利用海藻酸鈣固定衣藻，最終制備成線狀凝膠；
[0008]第三步:木醋桿菌接種至發酵培養基中后，加入第二步中制備的衣藻，進行發酵動態培養；
[0009]第四步:發酵結束，除去木醋桿菌細胞和衣藻，獲得純凈的細菌纖維素。
[0010]本發明與現有技術相比其顯著優點是:
[0011]1、衣藻作為一種產氧的微生物，與木醋桿菌共同培養，在發酵后期，為細菌產纖維素提供氧氣，能解決粘度帶來的溶氧問題；
[0012]2、木醋桿菌在發酵過程中會分泌乙酸，衣藻是以乙酸為碳源的微生物，能消耗發酵液中的乙酸，使環境pH維持在適宜的水平，有利于細菌纖維素的產生積累，兩種微生物共培養能實現互利共生
[0013]3、本發明涉及構建微生物共培養體系產細菌纖維的方法，工序簡便、操作性強，可實現規模化、工業化生產，能極大地降低用于提高溶解氧含量而帶來的動力消耗，并優化了木醋桿菌的生長條件，有利于縮短其生產周期。
[0014]下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述。
【附圖說明】
[0015]圖1 是本發明木醋桿菌 Acetobacter xy linum NUST4.2_ 衣藻 Chlamydomonas 共培養體系構建的流程圖。
[0016]圖2是對比例中木醋桿菌單獨發酵過程中BC產量與pH隨發酵時間變化圖。
[0017]圖3是實施例3中木醋桿菌-衣藻共培養過程中BC產量與pH隨發酵時間變化圖。
【具體實施方式】
[0018]結合附圖，構建木醋桿菌-衣藻共培養體系的方法，步驟如下:
[0019]第一步:木醋桿菌與衣藻分別在不同的生長條件下進行種子培養，其中木醋桿菌種子培養條件為:溫度25-32°C，搖床轉速90-250rpm，培養時間6-72h ;衣藻種子培養條件:溫度20-25°C，搖床轉速80-270rpm，光照培養箱中培養6_48h ；
[0020]第二步:將衣藻種子液經離心濃縮后，加入0.3-1.0% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中，通過控制微流控技術，利用注射栗注射至濃度為0.3-1.0% (w/v)氯化鈣溶液中進行固定化，衣藻固定于線狀凝膠中；
[0021]第三步:木醋桿菌以2-20%接種量接種至發酵培養基中后，加入第二步中制備的衣藻，在光照條件下進行發酵動態培養；
[0022]第四步:發酵結束，獲得的產物放入0.8-1.2mol/L pH7左右的磷酸緩沖溶液中震蕩，過濾，棄濾液，除去海藻酸鈣，隨后用含質量分數1_10%。(w/v) NaOH、1-10%。卜八)!1202的溶液在70-100°C條件下處理0.5-3.0小時，去離子水洗滌至pH中性，即可獲得純凈的細菌纖維素。
[0023]為了更好地理解本發明，下面通過具體的實施例來具體說明本發明的技術方案。
[0024]實施例1:
[0025]本發明為一種通過構建微生物共培養體系提高細菌纖維素產量的方法:
[0026]第一步:將兩種微生物各自在種子液中進行擴大培養。木醋桿菌放在30°C 160rpm搖床培養36h，衣藻放在22°C 160rpm光照培養箱中培養36h用于制備各微生物種子液；
[0027]第二步:將衣藻種子液經離心濃縮后，加入1mL0.8% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中，均勻混合后，用注射栗控制流速為200mL/h注射至濃度為1% (w/v)氯化鈣溶液中進行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器針頭容量10mL，內徑為0.4_，衣藻固定于線狀凝膠中；
[0028]第三步:木醋桿菌以8%接種量接種至發酵培養基中后，搖瓶動態發酵培養24h后加入第二步的固定化衣藻，進行發酵動態培養；
[0029]第四步:發酵結束后，將獲得的產物放入0.lmol/L pH = 7.8磷酸緩沖溶液中震蕩，過濾，棄濾液，除去固定化衣藻凝膠，然后用質量分數3%。(w/v)的NaOH和3%。(v/v)的H2O2在85°C條件下處理I小時，獲得的纖維素用去離子水洗滌至pH中性為止。
[0030]實施例2:
[0031]本發明為一種通過構建微生物共培養體系提高細菌纖維素產量的方法:
[0032]第一步:將兩種微生物各自在種子液中進行擴大培養。木醋桿菌放在29 °C 150rpm搖床培養36h，衣藻放在23°C 160rpm光照培養箱中培養36h用于制備各微生物種子液；
[0033]第二步:將衣藻種子液經離心濃縮后，加入1mLl.0% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中，均勻混合后，用注射栗控制流速為200mL/h注射至濃度為0.8% (w/v)氯化鈣溶液中進