一種原油降解菌的快速篩選方法
【專利說明】-種原油降解菌的快速篩選方法
[0001]
技術領域
[0002] 本發明設及微生物篩選方法技術領域，具體設及一種原油降解菌的快速篩選方 法。
【背景技術】
[0003] 原油及其副產品作為一種重要的能源物質和工業原料正在被世界各國的人們廣 泛開采，其在社會經濟發展中具有非常廣泛的作用與功能。但由于有限的技術及淡薄的環 保意識，使得環境中原油污染日益嚴重，破壞了正常的生態平衡。僅1996-1999年間在阿拉 斯加每年大概都有407起原油泄漏事故;2010年大連新港原油泄漏事件，至少污染了附近50 平方公里的海域，影響范圍達100平方公里。全世界每年約有800萬噸石油進入環境，如何安 全有效地對石油污染的水和±壤環境進行修復，降低生態風險，已成國際焦點問題。
[0004] 常用的原油污染修復手段有物理法、化學法及生物修復法。近年來，物理法和化學 法因為成本高，操作復雜，對設備要求高，會產生二次污染等缺點，逐漸被生物修復法代替。 生物修復法是利用微生物自身的代謝來分解污染物，其最終產物是C〇2、也0等物質，不會對 環境產生二次污染，所W被認為是一種綠色的處理方法，而且利用菌株能降解一些用物理、 化學方法不易降解的物質。
[0005] 環境中主要參與燒控降解的有細菌，真菌和酵母，目前研究發現降解活性最強，適 用性最廣的是細菌。目前，在對一些環境的研究中，已經分離或檢測到多種原油降解菌，如 表1顯示為不同環境原油降解菌群落(龍吳知，2014)。然而大量菌株其降解原油能力強弱的 篩選花費了很多人力物力。本發明提供一種原油降解菌快速篩選方法，可W快速并大量檢 測菌株的原油降解能力，并且測試結果準確可靠。
[0006]
a.克隆文庫或降解菌群落中序列或菌屬百分比(括號內）。
[0007] b.每個菌口中各菌屬百分比(無括號）。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種原油降解菌的快速篩 選方法。
[0009] 為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為:一種原油降解菌的快速篩選方法， 包括W下步驟： 1) 將分離純化得到的待測原油降解菌接種到液體培養基中，制成菌懸液； 2) 待步驟1)得到的菌懸液生長到對數期后，使用無菌牙簽沾取后接種于W原油為唯一 碳源的MM固體培養基中，在20~30°C的條件下培養，培養期為15d，得到培養菌落； 3) 對步驟2)得到的培養菌落進行觀察，W菌落直徑或菌落顏色判斷待測原油降解菌的 原油降解能力。
[0010] 進一步的，上述的一種原油降解菌的快速篩選方法，所述步驟1)中，待測原油降解 菌的分離純化方法為：將5g受原油污染的±樣置于45mL濃度為0.85%的生理鹽水中震搖 3〇111山，取±壤懸液梯度稀釋，涂布到21化固體培養基上，于20°C下倒置培養待長出肉眼可 見的單菌落;分離純化后，挑取單菌落于21化液體培養基中搖培成菌懸液。
[0011] 進一步的，上述的一種原油降解菌的快速篩選方法，所述21化固體培養基的組成 為：乙酸鋼1. Og，膜蛋白腺10.0 g，酵母提取物2. Og，巧樣酸鋼0.5g，硝酸錠0.2g，營養肉湯培 養基0X0ID 0.5g，瓊脂粉15g，dd出0 1L，抑調節至7.6;所述21化液體培養基的組成為：乙酸 鋼1. Og，膜蛋白腺10.0 g，酵母提取物2. Og，巧樣酸鋼0.5g，硝酸錠0.2g，營養肉湯培養基 0乂010 0.5邑，（1地2〇比，口的周節至7.6。
[0012] 進一步的，上述的一種原油降解菌的快速篩選方法，所述步驟2)中，MM固體培養基 的組成為：氯化儀3.5g，硝酸錠1. Og，氯化鐘0.35g，氯化巧0.05g，漠化鐘0.08g，氯化鐵 0 .Olg，含有硫酸鋒0.01%、氯化鎖2.4%的金屬鹽溶液ImL，含有憐酸氨二鐘10%、憐酸二氨鐘 10%的憐酸鹽溶液10血，瓊脂糖15g，d地2〇定容至1L，抑調節至7.5，最后加入體積百分比為 2〇/〇的原油。
[0013] 本發明的有益效果為:本發明提供的一種原油降解菌的快速篩選方法，可一次檢 測多個菌株是否具有較強的原油降解能力，同時得到多個菌株的降解結果，且操作簡單，效 率高，節省時間，具有很好的推廣使用價值。
【附圖說明】
[0014] 圖1為原油MM固體培養基上菌落的生長情況示意圖，其中A為菌株YF28-1(8)，B為 菌株YF24-3(3)，C為菌株TGkY2。
[0015] 圖2為降解菌株在原油MM液體培養基搖瓶培養結果示意圖。
[0016] 圖3為降解菌株對原油降解前后氣相圖譜，其中A為陰性對照，B為菌株TGL-Y2，c為 菌株 YF28-1(8)，D 為菌株 YF24-3(3)。
【具體實施方式】 [0017]實施例1: 原油降解菌降解能力強弱的篩選： 1、培養基的配制： 21化培養基：乙酸鋼1. Og，膜蛋白腺10 . Og，酵母提取物2. Og，巧樣酸鋼0.5g，硝酸錠 0.2邑，營養肉湯培養基(0乂010)0.5邑，(1地20比，口的周節至7.6左右。
[0018] MM培養基:氯化儀3.5g，硝酸錠1. Og，氯化鐘0.35g，氯化巧0.05g，漠化鐘0.08g，氯 化鐵0.0 lg，金屬鹽溶液1血(硫酸鋒0.01%，氯化鎖2.4%)，憐酸鹽溶液10血(憐酸氨二鐘10%， 憐酸二氨鐘10%)，瓊脂糖15g，dd出0定容至lL，pH調節至7.5左右，最后加2%(乂八)原油。
[0019] 2、原油降解菌的分離純化： 將5g受原油污染的±樣于45mL生理鹽水(0.85%)中震搖30min，取±壤懸液梯度稀釋， 涂布到21化固體培養基上，于2(TC下倒置培養。分離純化后，挑取單菌落于21化液體培養基 中搖培成菌液分成兩部分處理:一部分用20%滅菌甘油于-80°C冰柜中保存；另一部分進行 后續實驗。
[0020] 3、原油降解菌的降解能力測定： 將步驟2中獲得的菌液用牙簽接種到W原油為唯一碳源的MM固體