行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器針頭容量10mL，內徑為0.4mm，衣藻固定于線狀凝膠中；
[0034]第三步:木醋桿菌以4%接種量接種至發酵培養基中后，搖瓶動態發酵培養24h后加入第二步的固定化衣藻，進行發酵動態培養；
[0035]第四步:發酵結束后，將獲得的產物放入0.lmol/L pH = 7.8磷酸緩沖溶液中震蕩，過濾，棄濾液，除去固定化衣藻凝膠，然后用質量分數3%。(w/v)的NaOH和3%。(v/v)的H2O2在100°C條件下處理0.5小時，獲得的纖維素用去離子水洗滌至pH中性為止。
[0036]實施例3:
[0037]本發明為一種通過構建微生物共培養體系提高細菌纖維素產量的方法:
[0038]第一步:將兩種微生物各自在種子液中進行擴大培養。木醋桿菌放在29°C160rpm搖床培養36h，衣藻放在22°C 160rpm光照培養箱中培養36h用于制備各微生物種子液；
[0039]第二步:將衣藻種子液經離心濃縮后，加入1mL0.8% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中，均勻混合后，用注射栗控制流速為200mL/h注射至濃度為1.0% (w/v)氯化鈣溶液中進行固定化，固定化衣藻所用一次性注射器針頭容量10mL，內徑為0.4mm，衣藻固定于線狀凝膠中；
[0040]第三步:木醋桿菌以10%接種量接種至發酵培養基中后，搖瓶動態發酵培養36h后加入第二步的固定化衣藻，進行發酵動態培養；
[0041]第四步:發酵結束后，將獲得的產物放入0.lmol/L pH = 8.0磷酸緩沖溶液中震蕩，過濾，棄濾液，除去固定化衣藻凝膠，然后用質量分數3%。(w/v)的NaOH和3%。(v/v)的H2O2在90°C條件下處理0.7小時，獲得的纖維素用去離子水洗滌至pH中性為止。
[0042]對比例:
[0043]木醋桿菌單獨培養生產細菌纖維素的方法:
[0044]第一步:木醋桿菌種子液擴增培養。木醋桿菌放在29°C 160rpm搖床培養36h，獲得木醋桿菌種子液；
[0045]第二步:木醋桿菌以10%接種量接種至發酵培養基中后，搖瓶動態發酵培養4天;
[0046]第三步:發酵結束后，將獲得的產物質量分數3%。(w/v)的NaOH和3%。(v/v)的H2O2在90°C條件下處理0.7小時，獲得的纖維素用去離子水洗滌至pH中性為止。
[0047]圖2是對比例中木醋桿菌單獨發酵過程中BC產量與pH隨發酵時間變化圖。圖3是實施例3中木醋桿菌-衣藻共培養過程中BC產量與pH隨發酵時間變化圖。對比發現，木醋桿菌單獨發酵培養，經24h，pH開始大幅下降，至48h，pH降至最低3.38。木醋桿菌單獨培養至24h時，發酵液中溶解氧(DO)降至4%，直至發酵末期，DO值才稍有回升。在木醋桿菌-衣藻共培養體系中，pH 一直維持在4.40以上，DO值也維持在35 %以上，說明該體系能較好地維持發酵PH，衣藻能為發酵過程提供氧氣。對于BC的生產，木醋桿菌單獨發酵培養96h，BC產量為3.67g/L0在共培養體系條件下，經96h發酵，BC產量達5.21g/L。
[0048]綜上所述，通過構建微生物共培養體系生產細菌纖維素的方法，實現兩種微生物互利共生，能有效解決BC發酵后期粘度過高造成的溶氧問題，同時維持發酵過程中pH相對穩定，細菌纖維素的產量也獲得大幅提升。
[0049]上述實施例不以任何方式限制本發明，凡是采用等同替換或等效變換的方式獲得的技術方案均落在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1.一種微生物共培養體系產細菌纖維素的方法，其特征在于采用木醋桿菌與衣藻兩種微生物共培養的方法，構建共培養體系，步驟如下: 第一步:木醋桿菌與衣藻分別進行種子培養； 第二步:將衣藻種子液經離心濃縮后，獲得衣藻細胞，經微流控技術固定于海藻酸鈣中，最終制備成線狀凝膠； 第三步:木醋桿菌接種至發酵培養基中后，加入第二步中制備的衣藻凝膠，進行發酵動態培養； 第四步:發酵結束，除去木醋桿菌細胞和衣藻，獲得純凈的細菌纖維素。2.根據權利要求1所述的構建共培養體系的方法，其特征在于:第一步木醋桿菌與衣藻用各自的種子液在不同培養條件下進行種子擴增培養。3.根據權利要求1所述的構建共培養體系的方法，其特征在于:第一步木醋桿菌培養條件??溫度25-32°C，搖床轉速90-250rpm，培養時間6_72h。4.根據權利要求1所述的構建共培養體系的方法，其特征在于:第一步衣藻培養條件:溫度20-25°C，搖床轉速80-270rpm，光照培養箱中培養6_48h。5.根據權利要求1所述的構建共培養體系的方法，其特征在于:第二步衣藻種子液濃縮液加入濃度0.3-1.0% (w/v)的海藻酸鈉溶膠中，用注射栗控制流速在0.1?lOOmm/s范圍內。6.根據權利要求1所述的構建共培養體系，其特征在于:第二步注射至濃度為0.3-1.0% (w/v)氯化鈣溶液中進行固定化，衣藻固定于線狀凝膠中。7.根據權利要求1所述的構建共培養體系方法，其特征在于:第三步木醋桿菌接種量為 2-20% ο8.根據權利要求1所述的構建共培養體系的方法，其特征在于:第四步除去固定化衣藻凝膠的方法:將獲得的產物放入0.5-1.2mol/LpH 7左右的磷酸緩沖溶液中震蕩，過濾，棄濾液。9.根據權利要求1所述的構建共培養體系的方法，其特征在于:第四步除去木醋桿菌細胞的方法:用質量分數1-10%。(w/v)的NaOH和1_10%。(v/v)的H2O2在70-100°C條件下處理0.5-3.0小時，去離子水洗滌至pH中性為止。
【專利摘要】本發明公開了一種構建微生物共培養體系產細菌纖維素的方法。所述方法是將木醋桿菌(Acetobacter？xylinum？NUST4.2)與衣藻(Chlamydomonas)分別進行種子擴增培養，利用微流控技術將衣藻細胞固定于海藻酸鈣中，隨后進行共培養；培養完畢，除去木醋桿菌細胞和衣藻，獲得純凈的細菌纖維素。本發明中利用的衣藻是一種產氧的微生物，在發酵后期，為細菌產纖維素生產提供氧氣，能解決粘度帶來的溶氧問題。除此，木醋桿菌在在發酵過程中會分泌乙酸，衣藻是以乙酸為碳源的微生物，能消耗發酵液中的乙酸，使環境pH維持在適宜的水平。本發明方案為解決發酵后期粘度過高造成的溶氧問題及維持發酵過程中pH穩定提供了可行的解決方法，提供了一種產細菌纖維素的微生物共培養體系的方法。
【IPC分類】C12R1/02, C12R1/89, C12P19/04, C12P39/00
【公開號】CN105671115
【申請號】
【發明人】孫東平, 張衡, 楊加志, 朱春林, 陳春濤, 黃洋, 陳嘯
【申請人】南京理工大學
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日