培養基中，10°C下 倒置培養。15d左右統計菌落生長情況，若菌落直徑越大或菌落顏色越深，則該待測菌株具 有較強的原油降解能力。如圖1所示，通過培養，發現菌株YF28-U8)菌落顏色較深；菌株 YF24-3(3)菌落直徑較大;菌株TGL-Y2菌落直徑較小，顏色較淺。
[0021] 實施例2: 原油降解菌降解能力的驗證： 1、降解菌液體搖瓶培養： 將實施例1步驟2中獲得的菌株YF28-l(8)、YF24-3(3)和TGkY2菌液離屯、，棄掉上清后 用無菌生理鹽水洗涂并調整菌液濃度至〇〇6〇〇=0.7,接種菌液到Wl%(v/v)原油為唯一碳源 的MM液體培養基中，20°C震蕩培養7d。單菌生長情況通過OD600表征，同時用重量法對原油降 解率進行測定，W未接種菌的原油培養基作為陰性對照，每株菌設Ξ個平行。經培養7d后發 現，菌株YF28-1 (8)和YF24-3(3)的原油MM培養基搖瓶內培養液非常混濁，原油分散，油膜 少;而菌株TGL-Y2的培養液則相對較清澈，油膜較多。培養結果如圖2所示。
[0022] 2、降解率測定： 使用重量法對步驟1中的菌株其降解率進行測定，菌株對原油降解率測定結果如表2 所示。
[0023] 表 2
重量法：往振蕩7d的MM液體培養基中加入lOmL石油酸，晃勻萃取，并將培養液W 500化· mirfi離屯、lOmin，轉至分液漏斗，振蕩多次，靜置分層后，收集上層液，用石油酸洗涂 后合并上層液，在烘箱中65Γ蒸干稱重。計算降解率，計算公式如下：
3、通過GC-MS進行驗證： 同步驟1中的方法，將培養7d的菌液及正己燒的洗涂液全部倒入60ml的分液漏斗，充分 震蕩使其中剩余原油充分萃取到有機溶劑相中，靜置分層后用無水化2S化脫水，用0.22μπι 耐有機溶劑濾膜過濾，將過濾后的溶液進行GC-MS分析。
[0024] 實驗所用色譜柱為VARIAN(30 mX0.25 mmX0.25皿)石英毛細管柱;檢測器溫度 為280°C ;升溫程序:60°C恒溫2min，W升溫速率為8°C/min升溫到280°C，然后再恒溫5min; 載氣(化)流量為1血/min;進樣口溫度為270°C;進樣量為2化;分流比為1:1 (V/V)。
[00巧]從圖3可W發現，相比陰性對照，菌株YF28-1 (8)、YF24-3( 3)對原油中的燒控組分 均有不同程度的降解，其中對直鏈的飽和燒控具有較強的生物降解作用，且無論是偶碳數 還是奇碳數飽和燒控都具有較強的降解能力；而TGkY2雖有一定的降解能力，但是降解效 果均不及菌株￥。28-1(8)、￥。24-3(3)，運與實施例1所得結果一致。
[0026]最后應說明的是：W上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明， 盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可 w對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。 凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的 保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種原油降解菌的快速篩選方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將分離純化得到的待測原油降解菌接種到液體培養基中，制成菌懸液； 2) 待步驟1)得到的菌懸液生長到對數期后，使用無菌牙簽沾取后接種于以原油為唯一 碳源的MM固體培養基中，在20~30 °C的條件下培養，培養期為15d，得到培養菌落； 3) 對步驟2)得到的培養菌落進行觀察，以菌落直徑或菌落顏色判斷待測原油降解菌的 原油降解能力。2. 根據權利要求1所述的一種原油降解菌的快速篩選方法，其特征在于，所述步驟1) 中，待測原油降解菌的分離純化方法為:將5g受原油污染的土樣置于45mL濃度為0.85%的生 理鹽水中震搖30min，取土壤懸液梯度稀釋，涂布到216L固體培養基上，于20°C下倒置培養； 待長出肉眼可見的單菌落時分離純化，挑取單菌落于216L液體培養基中搖培成菌懸液。3. 根據權利要求2所述的一種原油降解菌的快速篩選方法，其特征在于，所述216L固體 培養基的組成為：乙酸鈉1. 〇g，胰蛋白胨10. 〇g，酵母提取物2.0g，檸檬酸鈉0.5g，硝酸銨 〇.2g，營養肉湯培養基OXOID 0.5g，瓊脂粉15g，ddH20 lL，pH調節至7.6;所述216L液體培養 基的組成為：乙酸鈉1. 〇g，胰蛋白胨10. 〇g，酵母提取物2.0g，檸檬酸鈉0.5g，硝酸銨0.2g，營 養肉湯培養基OXOID 0.5g，ddH20 lL，pH調節至7.6。4. 根據權利要求1-3任一所述的一種原油降解菌的快速篩選方法，其特征在于，所述步 驟2)中，MM固體培養基的組成為:氯化鎂3.5g，硝酸銨1.0g，氯化鉀0.35g，氯化鈣0.05g，溴 化鉀0.08g，氯化鐵0.01g，含有硫酸鋅0.01%、氯化鍶2.4%的金屬鹽溶液lmL，含有磷酸氫二 鉀10%、磷酸二氫鉀10%的磷酸鹽溶液10mL，瓊脂糖15g，ddH 20定容至1L，pH調節至7.5，最后 加入體積百分比為2%的原油。
【專利摘要】本發明公開了一種原油降解菌的快速篩選方法，包括以下步驟：1）將分離純化得到的待測原油降解菌接種到液體培養基中，制成菌懸液；2）待步驟1）得到的菌懸液生長到對數期后，使用無菌牙簽沾取后接種于以原油為唯一碳源的MM固體培養基中，在20～30℃的條件下培養，培養期為15d，得到培養菌落；3）對步驟2）得到的培養菌落進行觀察，以菌落直徑或菌落顏色判斷待測原油降解菌的原油降解能力。本發明的有益效果為：本發明提供的一種原油降解菌的快速篩選方法，可一次檢測多個菌株是否具有較強的原油降解能力，同時得到多個菌株的降解結果，且操作簡單，效率高，節省時間，具有很好的推廣使用價值。
【IPC分類】C12Q1/02
【公開號】CN105671116
【申請號】
【發明人】常思靜, 楊蕊琪, 章高森, 陳拓, 劉光琇, 張威
【申請人】中國科學院寒區旱區環境與工程研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2015年12月3日