PCR是否成功，加設一管陰性對 照組，共做9管PCR，所述陰性對照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0017] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0018] 將裝有反應溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性 95°C 3min ;熱循環 94°C 30s，6(TC 30s，72°C 30s，35 個循環；延伸 72°C 3min。反應 結束后，取出試管。
[001引由于9管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求16條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析 來設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0020] (3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0021] 檢測得到4個基因 分型分析結果如下;_
根據W上分型結果計算4個基因對該測試者皿L的貢獻總值（Y); Υ=2*1. 27+0. 57+2*3. 39-1. 5=8. 39mg/化 計算公式的含義是rs2271293的每個A代表1. 27mg/化，rsl7145738的每個T代表增 加0. 57mg/化，rs3764261的每個A代表增加3. 39mg/化，rs964184代表每個G減少1. 5mg/ dL。根據分型結果帶入公式求和既得4個基因對皿L的總貢獻值。因此，該測試者較人群 均值的皿L增加 8. 39mg/化，送表示其內在體質狀況應該較佳。如果臨床檢測的皿L值較 低，可能該人存在某種潛在的健康風險未被發現，需要極早排查。
[0022] W上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用W限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在于： 存放的試劑包括： (1) 針對4個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組： 針對SNP rs2271293的引物組： 5, -CAGGGTCAATGGGGTAA-3， 5' -CACTATCAACATCTTC-3' 5' -TGAGCCACCGTGCCTG-3' 5, -GCGTCAATCTGAAAAAGG-3， 針對SNP rsl7145738的引物組： 5' -GACCCTTCACACATTTAC-3' 5, -GTCAGATGGGCACCA-3' 5' -TGAAGCAATTTCTGC-3' 5, -GAACTCCTGACCTCAAA-3' 針對SNP rs3764261的引物組： 5, -GGTAGGCATCTGGG-3， 5, -TGAGATAGCAGACAAA-3， 5' -TATGTCCCTTAGAGGAATG-3' 5' -GGTGCAGGTTATCCCG-3' 針對SNP rs964184的引物組： 5' -GATGTACTGTTTTCCTC-3' 5' -ATGACAATAAACAGATC-3， 5' -TCAGCTTTGCCCAAATG-3' 5' -AGCACTGGCCTCTGTA-3' (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量 均為 〇. 5-1. Ο μ 1。3. 根據權利要求1所述的高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增 試劑包括：l〇XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖 液包含：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增 試劑用量為：l〇XPCR緩沖液2. 5μ 1，dNTPs2l·! 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據權利要求1所述的高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝 膠電泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上樣緩 沖液。7. 根據權利要求6所述的高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒 染料優選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據權利要求1所述的HDL基因檢測試劑盒，其特征在于：高密度脂蛋白基因對體 重的總貢獻值為各基因對體重貢獻值之和。9. 其單位是mg/dL，根據權利要求8所述的計算方法，其特征在于：各基因對體重的貢 獻值為α X β，α為系數，β為基因的影響因子，α系數是各個基因分型結果當中不同差 異堿基個數，β為單個差異堿基的影響因子單位是mg/dL。
【專利摘要】本發明提供了人體高密度脂蛋白基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對4個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到其體內高密度脂蛋白的遺傳因素，從而為受測者獲得一個合適的健康方案，評估相應健康風險，采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671132
【申請號】
【發明人】李則軒, 張舒, 邱嘉銘, 別茜, 張靜靜, 朱軼凡
【申請人】武漢白原科技有限公司
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日