苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干凈離必管內；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干 凈離必管內；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-2(TC靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離必10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5血70 %己醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離必5分鐘，棄上清液，此步驟重復一次；得到的沉淀物自然風 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-2(TC保存。
[001 引（2)PCR 擴增 本實施例同時檢測RS9398652、RS11154022、RS452036和RS223116。每個SNP的檢測 需要一對上下游引物、兩條多態引物共4條PCR引物，共需要16條引物。每個SNP的檢測 需要做兩管PCR擴增，為防止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對 照組，共做9管PCR，所述陰性對照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0016] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0017] 將裝有反應溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設置反應條件如下： 預變性 95°C 3min ;熱循環 94°C 30s，6(TC 30s，72°C 30s，35 個循環；延伸 72°C 3min。反應 結束后，取出試管。
[001引由于9管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高 效性、特異性，要求16條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析 來設計PCR引物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態性的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0019] ( 3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0020] 檢測得到4個基因分型分析結果如下
根據W上分型結果，該測試者的基因對必跳的貢獻值（Υ)等于： 2*0. 95-0. 43+2*0. 58+0. 55=3. 18bpm。其根據如下；RS939865 每個 A 增加必跳 0. 95bpm， RS11154022 每個 A 降低必跳 0. 43bpm，RS452036 每個 A 增加 0. 58bpm，RS223116 每個 A 增 加必跳0.55bpm。在得出基因貢獻值后，依據公式出町。X = 163 + (1.16 X age) - (0.018 X age2)巧得出該人的最大必率為184. 78bpm。依據公式：HRrewrve = HIU - HRre"和T皿 =(化町ax - HRrest) X 〇/〇 intensity) + HRrest W及下表得出目標必率（T皿）。
[0021] 比如該測試者在健身房跑步機進行有氧運動，則其運動強度屬于中度級別，根據 上述計算描述，該人的目標必率應在；116- 138bpm之間。
[0022] W上所述僅為本發明的較佳實施例，并不用W限制本發明，凡在本發明的精神和 原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，其特征在 于：存放的試劑包括： (1) 針對4個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組： 針對SNP RS9398652的引物組： 5' -CATATAGAGCTTTATTTCAA-3' 5' -GAAATCAGAATAGATTTG-3， 5' -GACCTTTATCATGTC-3' 5, -AACCACACGCTCACCTTAG-3' 針對SNP RS11154022的引物組： 5, -CAGAGGCTTGGGAGGA-3， 5' -CCACCTCCCTCTTTC-3' 5' -GGAAGACAAATGTTAC-3' 5' -CTGGGATTACAGGC-3' 針對SNP RS452036的引物組： 5, -CCTGCAACCACCCAA-3' 5' -GTCTAGAGCCCCAC-3' 5, -ACAAACAAGACCGGAATG-3， 5' -TCTGCAGGTGACCCTGG-3' 針對SNP RS223116的引物組： 5' -CCCTATTCCCAAACAA-3' 5' -GTATTTGTAGTAACAAGTAC-3' 5' -GCCTTTGGAGATCTC-3' 5' -TGCTTAGTCCTCCTC-3' (2) PCR擴增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據權利要求1所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物 用量均為0. 5-1. 0 μ 1。3. 根據權利要求1所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR 擴增試劑包括：l〇XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動Taq酶，基因組模板。4. 根據權利要求3所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR 緩沖液包含：l〇〇mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據權利要求3所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR 擴增試劑用量為：l〇XPCR緩沖液2. 5μ l，dNTPs2l·! 1，熱啟動Taq酶0. 1-0. 2μ 1，基因組模 板 50_100ng。6. 根據權利要求1所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂 糖凝膠電泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、DNA無毒染料和DNA上 樣緩沖液。7. 根據權利要求6所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA 無毒染料優選Biotium Gelred無毒染料。8. 根據權利要求1所述的最大心率、目標心率基因檢測試劑盒，其特征在于：最大心 率、目標心率基因對最大心率的總貢獻值為各基因對心率貢獻值之和，其單位是bpm。9. 根據權利要求8所述的計算方法，其特征在于：各基因對心率的貢獻值為a X β，a 為系數，β為基因的影響因子，α系數是各個基因分型結果當中不同差異堿基個數，β為 單個差異堿基的影響因子單位是bpm。10. 根據權利要求1所述，該試劑盒檢測結果的計算公式為：HR_ = 163 + (1.16 X age) - (0.018 X age2)+Y，以及由此推算的目標心率 HRreserve = HR_ - HRrest 和 THR = ((HR_ - HRrest) X % intensity) + HRrest，Y為權利要求8和9中所計算出的基因對心率 的貢獻值。
【專利摘要】評估人體最大心跳、目標心跳的檢測試劑盒和計算方法。本發明提供了人體最大心率的基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內單獨存放的試劑，試劑包括：（1）針對4個基因SNP多態位點的PCR反應引物組（2）PCR擴增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應可在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到其最大心率的遺傳因素，從而為受測者獲得一個合適在健身運動時合理的心跳范圍，評估相應心臟健康風險，采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。同時也為專業運動員提供訓練階段的心率指標。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105671136
【申請號】
【發明人】李則軒, 邱嘉銘, 別茜, 張靜靜, 張舒, 朱軼凡, 范家成, 盧駿
【申請人】武漢白原科技有限公司, 湖北省體育科學研究所
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2014年11月17日